融合蛋白及纯化制备方法和应用

本发明属于免疫学领域，涉及一种融合蛋白及纯化制备方法和应用，尤其涉及一种由cd19单链抗体可变区(cd19scfv)和引发针对致病性结核分枝杆菌(mycobacterialtuberculosis，m.tb)免疫应答的抗原esat-6组合而成的融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术：

1、目前，结核病仍然是世界领先的传染性死因，急需采取新的预防策略来减轻疾病的负担。目前卡介苗(bacille calmette-guérin，bcg)是广泛应用于临床的预防结核分枝杆菌的疫苗，对儿童结核病的预防效果较好，但存在着对成年人的保护效力不足的缺点[1]。很多候选疫苗几乎都被设计为bcg的增强剂或者改良剂，与bcg具有共享抗原成分，被称为亚单位疫苗，共享抗原成分引起的“交叉反应”的存在使得大多数新型候选疫苗依旧难以有效提升bcg的保护效能[2]。

2、esat-6作为引发特异性抗m.tb免疫反应的强抗原，不与bcg共享抗原成分[3]，被广泛用于结核病疫苗研究中。研究证实巨噬细胞tlr2识别毒性m.tb免疫原性分子esat-6，可以激活胞内pi3k-akt通路[4]。esat-6还可以通过sod-2调节自噬反应，从而诱导牛分枝杆菌bcg的胞内存活[5]。当bcg与esat-6联合免疫时，不仅可能激活tlr2-pi3k-akt通路，还能改善bcg在体内的存活，从而加强接种个体对致病性m.tb的免疫记忆反应。

3、作为体液免疫应答的主要参与者b细胞，近年来也有越来越多的证据表明其在调节t细胞功能方面的重要作用，如b细胞tlr2信号导致nf-κb活化、引发白细胞介素il-6产生，进而促进cd4+t细胞向辅助性t细胞17(th17)分化[6]，而th17细胞介导炎症和中性粒细胞募集有助于清除感染的m.tb[7]；构成绝大多数淋巴滤泡(包括诱导性支气管相关淋巴组织ibalt)的滤泡辅助性t细胞(tfh)是以b细胞辅助的方式从记忆t细胞扩增而来[8]；b细胞和t细胞之间的相互作用对于对结核病的肉芽肿保护反应的正常发展至关重要[9]。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种既能避免亚单位疫苗中的共享抗原引起的“交叉反应”、又能以靶向放大b细胞活化通路的方式增强免疫应答，进而提升bcg的免疫效能的融合蛋白及纯化制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是卡介苗的佐剂，所述融合蛋白包括cd19单链抗体以及全长esat-6蛋白的融合蛋白，所述cd19单链抗体与全长esat-6蛋白相连。

4、作为优选，本发明所采用的融合蛋白的融合方式为cd19scfv-esat-6；所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、用于编码如前所述的融合蛋白的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列如seq idno.2所示。

6、一种基于如前所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

7、1)设计如前所述的融合蛋白的结构；

8、2)构建重组表达载体pet-28a-cd19scfv-esat-6；

9、3)将步骤2)构建得到的重组表达载体pet-28a-cd19scfv-esat-6转化至蛋白表达菌株bl-21中，并对蛋白表达菌株bl-21进行扩大培养；

10、4)融合蛋白cd19scfv-esat-6的原核表达。

11、作为优选，本发明所采用的步骤1)的具体实现方式是：在ncbi数据库中查找早期分泌蛋白抗原esat-6的核苷酸序列，将工具分子cd19scfv与esat-6分子组装在一起，通过生物信息学软件的分析加入相应连接序列，设计成具有科学合理结构的融合蛋白。

12、作为优选，本发明所采用的步骤2)的具体实现方式是：利用分子克隆技术分别合成cd19scfv基因和esat-6基因，通过重叠pcr的方式将cd19scfv基因和esat-6基因整合成cd19scfv-esat-6基因，最后将cd19scfv-esat-6基因克隆至pet28a载体中，构建重组表达载体pet-28a-cd19scfv-esat-6。

13、作为优选，本发明所采用的步骤4)的具体实现方式是：利用iptg诱导融合蛋白在包涵体中表达，用尿素溶解后通过beyogold his-tag purification resin镍离子亲和层析和透析袋透析，获得融合蛋白cd19scfv-esat-6。

14、如前所述的融合蛋白在作为bcg疫苗佐剂或预防结核病方面的应用。

15、作为优选，本发明所采用的融合蛋白引起明显免疫反应的有效剂量不低于8μg。

16、本发明所述的融合蛋白佐剂采用原核表达体系，经表达纯化后，用于提升bcg的免疫效能，相对于现有候选疫苗，具有以下优点：

17、本发明所提供的融合蛋白，包括cd19单链抗体以及全长esat-6蛋白的融合蛋白，融合方式为cd19scfv-esat-6，制备工艺简单，成本较低。本发明是依据b细胞在结核病发展过程中的潜在作用和esat-6的免疫学功能，并以增强b细胞活性为切入点，将能够靶向活化b细胞的cd19scfv与esat-6组成融合蛋白，通过分子克隆等技术成功构建了cd19scfv-esat-6，并通过原核表达和蛋白纯化等技术，获得了纯化蛋白cd19scfv-esat-6，以期作为bcg的免疫增强剂，提升疫苗的免疫效能。在bcg免疫过程中，融合蛋白中的cd19scfv具有靶向活化b细胞的能力，促使esat-6单独活化b细胞tlr2信号，从而显著提升保护性免疫反应的效能。融合蛋白中的esat-6不与bcg共享抗原成分，能够对bcg引起的免疫效应起到补充作用，并且避免了抗原成分之间引起的“交叉反应”。融合蛋白中的esat-6可以改善bcg在体内的存活，辅助增强bcg的疫苗效能。相较于现有候选疫苗，本文提供的融合蛋白具有制备工艺简单、成本低和效应性好”的优点。

技术特征：

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是卡介苗的佐剂，所述融合蛋白包括cd19单链抗体以及全长esat-6蛋白的融合蛋白，所述cd19单链抗体与全长esat-6蛋白相连。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的融合方式为cd19scfv-esat-6；所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。

3.用于编码如权利要求1或2所述的融合蛋白的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列如seq id no：2所示。

4.一种基于如权利要求2所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：在ncbi数据库中查找早期分泌蛋白抗原esat-6的核苷酸序列，将工具分子cd19scfv与esat-6分子组装在一起，通过生物信息学软件的分析加入相应连接序列，设计成具有科学合理结构的融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的具体实现方式是：利用分子克隆技术分别合成cd19scfv基因和esat-6基因，通过重叠pcr的方式将cd19scfv基因和esat-6基因整合成cd19scfv-esat-6基因，最后将cd19scfv-esat-6基因克隆至pet28a载体中，构建重组表达载体pet-28a-cd19scfv-esat-6。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)的具体实现方式是：利用iptg诱导融合蛋白在包涵体中表达，用尿素溶解后通过beyogold his-tag purificationresin镍离子亲和层析和透析袋透析，获得融合蛋白cd19scfv-esat-6。

8.如权利要求1或2所述的融合蛋白在作为bcg疫苗佐剂或预防结核病方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述融合蛋白引起明显免疫反应的有效剂量不低于8μg。

技术总结
本发明属于免疫学领域，具体公开了一种融合蛋白及纯化制备方法和应用，融合蛋白是卡介苗的佐剂，融合蛋白包括CD19单链抗体以及全长ESAT‑6蛋白的融合蛋白，CD19单链抗体与全长ESAT‑6蛋白相连。本发明提供了一种既能避免亚单位疫苗中的共享抗原引起的“交叉反应”、又能以靶向放大B细胞活化通路的方式增强免疫应答，进而提升BCG的免疫效能的融合蛋白及纯化制备方法和应用。

技术研发人员：潘勤,周芳婷
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15