一种双网络交联水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种医疗和生物工程用品，特别是涉及一种双网络交联水凝胶的制备方法及其应用，属于生物医用材料领域。

背景技术：

1、天然生物高分子水凝胶是由生物高分子聚合物交联形成的一类三维网络状水凝胶，可以吸纳大量的水，具有类细胞外基质的特质，为细胞粘附和组织重塑提供了一个良好的微环境。生物高分子水凝胶在生物医用材料领域具有很好的应用潜力，如创面愈合敷料，止血材料，组织工程细胞支架，小分子药物、生长因子递送载体等，从医用材料的角度，也对生物高分子水凝胶的性能和安全性提出更高的要求。

2、温敏水凝胶是一种典型的物理交联水凝胶，具有温度变化响应性，在温敏点之下较低的温度条件下为液态，在温敏点之上的温度条件下为凝胶态。羟丁基壳聚糖水凝胶是一种温敏水凝胶，温敏点通常在15～18℃，由于制备条件的不同，还会出现更低的温敏点。博士学位论文《羟丁基壳聚糖的制备及其水凝胶敏感性（温度、ph）与生物相容性研究》（李晶晶，2011）详细研究了羟丁基壳聚糖水凝胶的流变学特性，论文摘要中记载了5%的羟丁基壳聚糖以蒸馏水为溶剂的成胶温度为16.5℃，ph7.4的pbs缓冲液为溶剂的成胶温度为15.5℃。这表明羟丁基壳聚糖水凝胶在近中性的正常ph条件下的成胶温度小于17℃，成胶温度偏低。论文摘要中还记载了羟丁基壳聚糖表现了较强的抑制l929细胞迁移的作用，羟丁基壳聚糖浓度为0.25mg/ml时对细胞迁移速度的抑制率可达到48%。硕士学位论文《温敏性羟丁基壳聚糖生物安全性研究》（陈寅生，2016）详细研究了羟丁基壳聚糖的生物安全性，论文摘要中记载了羟丁基壳聚糖浸提液对l929 细胞的毒性作用，其中25%浸提液组实验第2天和第4天的细胞的增殖率分别为44.6%和14.5%，都出现了细胞凋亡。因此，羟丁基壳聚糖温敏水凝胶在生物医用材料领域的应用还需要解决两个关键性技术问题：一是提高羟丁基壳聚糖温敏水凝胶的温敏点，现有的羟丁基壳聚糖的温敏点较低，通常低于17℃，在低温下为液体，在17℃以上为不流动的凝胶，低温敏点给温敏水凝胶在室温下的注射、导入、应用等操作带来了难度，在室温下的可操作时间较短；二是提高羟丁基壳聚糖的细胞相容性，现有的羟丁基壳聚糖表现了对l929成纤维细胞的抑制生长和抑制迁移作用，细胞相容性不好，这不利于羟丁基壳聚糖在体内组织的应用。在化学交联水凝胶中，生物高分子通过自身的醛基与氨基形成席夫碱是一种不需要引入外源交联剂的无残留有害物质的化学交联水凝胶，如氧化海藻酸钠水溶液与羟丙基壳聚糖水溶液混合，前者的醛基与后者的氨基通过席夫碱交联形成水凝胶。因此，生物高分子通过醛基与氨基形成席夫碱交联形成水凝胶，不引入有害残留物，也不产生有害残留物，是一种有医用潜力的水凝胶。但席夫碱的交联强度较弱，易发生水解，有其自身不稳定性的缺点。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种具有更好的凝胶强度和细胞相容性的由两种水性溶液形成的双网络交联水凝胶，以克服单交联水凝胶的缺点。

2、本发明的一种水性溶液是含有羧化羟丁基壳聚糖的水性溶液，另一种水性溶液是含双醛基的氧化多糖的水性溶液，两种水性溶液混合形成双网络交联水凝胶；所述的含双醛基的氧化多糖是含双醛基的氧化羟乙基纤维素、含双醛基的氧化羟丙基纤维素、含双醛基的氧化羧甲基纤维素钠盐或钾盐、含双醛基的氧化壳聚糖、含双醛基的氧化羟乙基壳聚糖、含双醛基的氧化羟丙基壳聚糖、含双醛基的氧化羧甲基壳聚糖钠盐或钾盐、含双醛基的氧化羟乙基甲壳素、含双醛基的氧化羟丙基甲壳素、含双醛基的氧化羧甲基甲壳素钠盐或钾盐、含双醛基的氧化透明质酸钠盐或钾盐，或含双醛基的氧化海藻酸钠盐或钾盐中的一种；所述的羧化羟丁基壳聚糖是在壳聚糖主链上有羟丁基和羧基结构的侧链，所述羧基结构的侧链是指在壳聚糖的-nh2位置接入包括羧甲基、羧乙基、羧丙基、羧丁基或琥珀酰基等具有羧基结构的侧链；所述的水性溶液是指溶剂是水、生理盐水、磷酸缓冲液、格林氏液、葡萄糖液或其它常用水性溶剂的溶液；所述的双网络水凝胶是由温敏性的物理交联网络和醛基与氨基反应生成的席夫碱的化学交联网络形成的双网络交联水凝胶。

3、进一步的，本发明含有羧化羟丁基壳聚糖的水性溶液中还可以包含其它水溶性壳聚糖，如羧甲基壳聚糖钠盐或钾盐、羧乙基壳聚糖钠盐或钾盐、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖中的一种或几种。

4、组成上述双网络交联水凝胶的两部分水性溶液，其中一种是含有羧化羟丁基壳聚糖或含有羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖的水性溶液（以下称为a液），该水性溶液具有温敏性，温敏点在20～37℃范围，该水性溶液的温敏特性来源于羧化羟丁基壳聚糖，羧化羟丁基壳聚糖是双网络水凝胶中物理交联网络的关键成分；所述的羧化羟丁基壳聚糖，其分子结构中同时具有羟丁基和羧基结构的侧链，羧基侧链的存在，打破了羟丁基壳聚糖水凝胶原有的氢键平衡，从而提高了羧化羟丁基壳聚糖水溶液的温敏点，温敏点在20～37℃范围，弥补了羟丁基壳聚糖温敏水凝胶温敏点低的现有技术不足；同时羧化羟丁基壳聚糖中的羧基结构具有负电性，削弱了-nh2原有的正电性，降低了正电荷对细胞的副作用，由此大大提高了上述羧化羟丁基壳聚糖的细胞相容性，无细胞毒性，弥补了羟丁基壳聚糖温敏水凝胶细胞相容性不理想的技术不足。

5、上述双网络交联水凝胶中另一种水性溶液是含双醛基的氧化多糖的水性溶液（以下称为b液），将a液与b液在a液温敏点之下的温度混合，再升高温度，混合液即形成双网络交联水凝胶；其中a液与b液混合时，a液中的羧化羟丁基壳聚糖的氨基或羧化羟丁基壳聚糖的氨基和水溶性壳聚糖的氨基与b液中的含双醛基的氧化多糖的醛基之间发生席夫碱交联，形成化学交联水凝胶，同时当温度大于a液的温敏点时，混合液中的羧化羟丁基壳聚糖发生温度响应，形成物理交联水凝胶；由此，当a液与b液混合时，在体温条件下，温敏性的物理交联和席夫碱的化学交联同时发生，形成了双网络水凝胶。该双网络水凝胶具有比单独的温敏性物理交联水凝胶、单独的席夫碱化学交联水凝胶具有更好的凝胶强度，延长了水凝胶的体内降解时间，提高了水凝胶的细胞相容性，使用操作方便。

6、本发明的第二个目的是提供上述由两种水性溶液组成的双网络交联水凝胶的制备方法，步骤如下：一、通过制备羧化羟丁基基壳聚糖获得具有更高温敏点的温敏性的羧化羟丁基壳聚糖水凝胶，以弥补羟丁基壳聚糖温敏水凝胶温敏点低的现有技术不足；二、制备氧化双醛基多糖；三、制备含有羧化羟丁基壳聚糖或含有羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖的水性溶液（a液），获得可温敏性物理交联的水凝胶网络，以及获得为席夫碱的化学交联提供氨基供体；三、是制备含双醛基的氧化多糖的水性溶液（b液），获得为席夫碱的化学交联提供醛基供体；四、将a液与b液混合，形成双网络交联水凝胶。

7、本发明的第三个目的是提供上述由两种水性溶液组成的双网络交联水凝胶的应用。

8、本发明的具体技术方案如下：

9、一种双网络交联水凝胶，其特征在于，所述双网络交联水凝胶由两种水性溶液组成，其中一种水性溶液是含有1～15%（m/v）的羧化羟丁基壳聚糖的水性溶液，另一种水性溶液是含有1～15%（m/v）的双醛基的氧化多糖的水性溶液，两种水性溶液混合形成双网络交联水凝胶；所述的含双醛基的氧化多糖是含双醛基的氧化羟乙基纤维素、含双醛基的氧化羟丙基纤维素、含双醛基的氧化羧甲基纤维素钠盐或钾盐、含双醛基的氧化壳聚糖、含双醛基的氧化羟乙基壳聚糖、含双醛基的氧化羟丙基壳聚糖、含双醛基的氧化羧甲基壳聚糖钠盐或钾盐、含双醛基的氧化羟乙基甲壳素、含双醛基的氧化羟丙基甲壳素、含双醛基的氧化羧甲基甲壳素钠盐或钾盐、含双醛基的氧化透明质酸钠盐或钾盐，或含双醛基的氧化海藻酸钠盐或钾盐中的一种，含双醛基的氧化多糖中含双醛基的糖单元占多糖总糖单元的百分数为5%～100%；所述的羧化羟丁基壳聚糖是在壳聚糖主链上有羟丁基和羧基结构的侧链，所述羧基结构的侧链是指羧甲基侧链，羧乙基侧链，羧丙基侧链，羧丁基侧链，琥珀酰基侧链，或其它带有羧基结构的脂肪族或芳香族的侧链。

10、进一步的，本发明含有羧化羟丁基壳聚糖的水性溶液中还可以包含其它水溶性壳聚糖，如羧甲基壳聚糖钠盐或钾盐、羧乙基壳聚糖钠盐或钾盐、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖中的一种或几种。

11、所述羧化羟丁基壳聚糖或含有羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖的水性溶液，其温敏点可以通过控制羧化羟丁基壳聚糖的含羧基结构的侧链长度和取代度的不同在20～37℃之间进行调节。

12、所述的水性溶液是指溶剂是水、生理盐水、磷酸缓冲液、格林氏液、葡萄糖液或其它常用水性溶剂的溶液；所述的双网络水凝胶是由温敏性的物理交联网络和醛基与氨基的席夫碱的化学交联网络形成的双网络水凝胶。

13、上述双网络交联水凝胶的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

14、（1）通过以下任一方法制备羧化羟丁基壳聚糖：

15、1）在30～90%（v/v）的有机溶剂的水溶液中，加入具有温敏性的羟丁基壳聚糖，搅拌分散，制成0.5～20%（m/v）的羟丁基壳聚糖悬液；按羟丁基壳聚糖与羧化试剂乙醛酸或乙酰丙酸的摩尔比为1:（0.1～5）的比例加入羧化试剂，室温或加热下搅拌反应1～24 h，反应后用稀碱液调反应体系的ph至中性或碱性；室温下向反应体系中缓慢滴加1～10%的nabh4水溶液，进行还原反应1～5 h；反应产物用乙醇水溶液洗涤脱盐、乙醇脱水、干燥，或将反应产物用4～10℃下或室温下去离子水透析，透析物进行冷冻真空干燥，得羧甲基羟丁基壳聚糖或羧丁基羟丁基壳聚糖，即羧化羟丁基壳聚糖。

16、2）在30～90%（v/v）的有机溶剂的水溶液中，加入具有温敏性的羟丁基壳聚糖，搅拌分散，制成0.5～20%（m/v）的羟丁基壳聚糖悬液；用稀碱液调反应体系的ph至中性或碱性，按羟丁基壳聚糖与羧化试剂氯乙酸或氯丙酸或氯乳酸或丙烯酸的摩尔比为1:（0.1～5）的比例，滴加羧化试剂的水溶液，室温或加热下搅拌反应1～24 h；反应后用稀酸或稀碱溶液调节反应体系的ph至中性，反应产物用乙醇水溶液洗涤脱盐、乙醇脱水、干燥，或反应物用4～10℃下或室温下去离子水透析，透析物冷冻真空干燥，得羧甲基羟丁基壳聚糖或羧乙基羟丁基壳聚糖，即羧化羟丁基壳聚糖。

17、3）在80～100%（v/v）的常用有机溶剂的水溶液中，加入具有温敏性的羟丁基壳聚糖，搅拌分散，制成0.5～20%（m/v）的羟丁基壳聚糖悬液；按羟丁基壳聚糖与羧化试剂琥珀酸酐（丁二酸酐）的摩尔比为1:（0.1～5）的比例，加入羧化试剂的有机溶剂溶液，室温或加热搅拌反应1～24 h；反应后用稀碱溶液调反应体系的ph至中性，反应产物用乙醇水溶液洗涤脱盐、乙醇脱水、干燥；或反应产物用4～10℃下或室温下去离子水透析，透析物冷冻真空干燥；得琥珀酰基羟丁基壳聚糖，即羧化羟丁基壳聚糖。

18、4）在50～90%（v/v）的常用有机溶剂的水溶液中，加入壳聚糖，搅拌分散，制成1～15%（m/v）的壳聚糖悬液，按壳聚糖与羧化试剂乙醛酸或乙酰丙酸的摩尔比为1:（0.1～5）的比例，滴加羧化试剂的水溶液（是否需要有浓度范围），室温或加热下搅拌反应1～24 h，反应后用稀碱液调反应体系的ph至中性或碱性；室温下向反应体系中缓慢滴加1～10%的nabh4水溶液，进行还原反应1～5 h；反应物用乙醇水溶液洗涤脱盐、乙醇脱水、干燥，得羧甲基壳聚糖或羧丁基壳聚糖，即羧化壳聚糖。在50～90%（v/v）的常用有机溶剂的水溶液中，加入羧化壳聚糖，搅拌分散，制成1～15%（m/v）的羧化壳聚糖悬液，用碱液调悬液的ph至碱性，加热搅拌下，按羧化壳聚糖n摩尔数与1,2-环氧丁烷的摩尔比为1:（5～30）的比例，滴加环氧丁烷，加热下搅拌反应12～48 h，反应后用稀酸液调反应体系的ph至中性；反应物用乙醇水溶液洗涤脱盐、乙醇脱水、干燥，或反应物用4～10℃下或室温下去离子水透析，透析物冷冻真空干燥，得羧化羟丁基化壳聚糖。

19、5）在50～90%（v/v）的常用有机溶剂的水溶液中，加入羧化壳聚糖，搅拌分散，制成1～15%（m/v）的羧化壳聚糖悬液，用碱液调悬液的ph至碱性，加热搅拌下，按羧化壳聚糖摩尔数与1,2-环氧丁烷的摩尔比为1:（5～30）的比例，滴加环氧丁烷，加热下搅拌反应12～48h，反应后用稀酸液调反应体系的ph至中性；反应物用乙醇水溶液洗涤脱盐、乙醇脱水、干燥，或反应物用4～10℃下或室温下去离子水透析，透析物冷冻真空干燥，得羧化羟丁基化壳聚糖；所述的羧化壳聚糖是指羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、羧丙基壳聚糖、羧丁基壳聚糖或琥珀酰基壳聚糖中的一种。

20、（2）制备含双醛基的氧化多糖：

21、配制1～15%（v/v）的多糖水溶液，按多糖与氧化剂的摩尔比为1︰（0.01～1）的比例，搅拌下加入氧化剂naio4或kio4固体，于4℃～室温避光反应2～36h；反应物经乙醇沉淀、乙醇水溶液洗涤脱盐、无水乙醇脱水、干燥，或反应物用4～10℃下或室温下去离子水透析，透析物冷冻真空干燥，得含双醛基的氧化多糖。

22、（3）制备含有羧化羟丁基壳聚糖或羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖的水性溶液：

23、取羧化羟丁基壳聚糖或羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖，配制成1～15%（m/v）的水性溶液，其中羧化羟丁基壳聚糖在羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖中占比不少于50%（m/m），得含羧化羟丁基壳聚糖/或和其它水溶性壳聚糖的具有温敏性的水性溶液。

24、（4）制备含双醛基的氧化多糖的水性溶液：

25、取含双醛基的氧化多糖，配制成1～15%（m/v）的水性溶液，得含双醛基的氧化多糖的水性溶液。

26、（5）制备由两种水性溶液组成的双网络交联水凝胶：

27、分别等体积取含有羧化羟丁基壳聚糖或羧化羟丁基壳聚糖和其它水溶性壳聚糖的水性溶液、含双醛基的氧化多糖的水性溶液，两种等体积溶液均匀混合，或分别装入双联注射器的两个针管中，同时推出、均匀混合，得由两种水性溶液组成的双网络交联水凝胶。

28、所述羧化试剂不仅限于上述具体的羧化试剂，本领域技术人员采用其它羧化试剂在壳聚糖的-nh2位置上接枝其它带有羧基结构的侧链都是可以实现本发明的目的，如羧甲基侧链，羧乙基侧链，羧丙基侧链，羧丁基侧链，琥珀酰基侧链，或其它带有羧基结构的脂肪族或芳香族的侧链。上述有机溶剂是指乙醇、异丙醇、丙酮、甲醇或其它常用有机溶剂。所述的水性溶液是指溶剂是水、生理盐水、磷酸缓冲液、格林氏液、葡萄糖液或其它常用水性溶剂。

29、所述双网络交联水凝胶的应用，其特征是在制备止血、创面渗出液封堵、脑脊液封堵的医疗器械或医用材料或药物中的应用。

30、所述双网络交联水凝胶的应用，其特征是在制备预防手术后组织粘连、腹腔粘连、创面愈合的医疗器械或医用材料或药物中的应用。

31、所述双网络交联水凝胶的应用，其特征是在制备消化道粘膜保护剂、泪道栓子、组织填充的医疗器械或医用材料或药物中的应用。

32、所述双网络交联水凝胶的应用，其特征是在制备细胞载体、细胞3d培养、药物载体、活性因子载体的医疗器械、医用材料、组织工程支架中的应用。

33、本发明的由两种水性溶液组成的双网络交联水凝胶是在体温条件下发生的温敏性的物理交联和席夫碱的化学交联形成的双网络水凝胶。该双网络水凝胶具有比单独的温敏性物理交联水凝胶、单独的席夫碱化学交联水凝胶具有更好的凝胶强度，延长了水凝胶的体内降解时间，提高了水凝胶的细胞相容性，使用操作方便。本发明的由两种水性溶液组成的双网络交联水凝胶可以在体内降解吸收，为其在制备体内和体外应用的可吸收医疗器械或医用材料或药物的应用奠定了重要基础。