AMA-M2重组抗原及其制备方法与应用与流程

本申请属于生物，具体涉及一种ama-m2重组抗原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、自身免疫疾病是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害引发疾病，常见的自身免疫疾病有：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。正常情况下免疫系统只会对侵入机体的外来物，如细菌、病毒等产生免疫反应。在免疫紊乱情况下，机体可攻击自身抗原引起一系列免疫反应，在免疫过程中可引起脏器损伤，出现一系列临床症状。

2、原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，pbc)就是一种慢性胆汁淤积性肝病，是一种以胆汁淤积和胆管纤维化为特点的自身免疫性肝病，该病好发于中老年女性，其主要特征是进行性、非化脓性、破坏性小胆管炎，最终导致纤维化和潜在的合并肝硬化。

3、pbc在临床上通常会经历四个阶段：临床前期，抗线粒体抗体(ama)阳性，碱性磷酸酶alp正常；无症状期，主要表现为生物化学指标异常，alp逐渐升高，但没有明显临床症状；症状期，患者出现乏力、皮肤瘙痒等临床症状，并可进展为肝硬化；终末期，患者发生肝衰竭，出现腹水、消化道出血、肝性脑病等并发症。随访发现近50％pbc早期患者在5年内会进展至中期或终末期。早期应用熊去氧胆酸治疗可改善高胆红素血症、延缓肝硬化。该病发展至终末期，则药物疗效甚微，唯一有效的治疗是肝移植。因此，pbc的早期诊断及治疗对改善患者健康状况具有非常重要的意义。

4、pbc患者的血清中可检测到抗线粒体(ama)-m2抗体、抗核抗体、抗核孔复合物抗体等多种自身抗体，其中以抗丙酮酸脱氢酶复合物(pdc)抗体为特征性免疫学异常。2015年原发性胆汁性胆管炎(pbc)诊断和治疗共识提出免疫学检查中ama阳性是最具诊断价值的实验室检查。ama分为9个亚型m1-m9，其中以m2最为重要，可在无症状期前被检测到。原发性胆汁性肝硬化症敏感、特异性实验，高滴度的ama-m2在原发性胆汁性肝硬化中阳性率>90％，常用作原发性胆汁性肝硬化症的重要实验室诊断指标。

5、而传统技术例如cn1445369a，在大肠杆菌中表达与硫氧还蛋白融合的pdc e2抗原-二氢脂乙酰转移酶(dpat)1-355aa的部分多肽采用ni亲和层析法纯化融合蛋白，但由于缺少部分表位，存在很大的漏检风险。现有技术cn111560362b虽然采用三联体抗原但仅选择了蛋白片段，并且在连接过程中仍然存在结构域之间构象容易受位阻效应影响以及灵敏度与特异性低的技术问题。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供一种ama-m2重组抗原及其制备方法，以解决传统技术中由于结构域之间构象容易受位阻效应影响所导致的灵敏度与特异性低的技术问题。

2、本申请一方面提供一种ama-m2重组抗原，所述重组抗原氨基酸序列如seq idno.1所示。

3、在其中一个实施例中，所述重组抗原c端连接有标签蛋白。

4、在其中一个实施例中，所述标签蛋白为his、flag、ha、c-myc、avitag、snap或flag标签。

5、本申请另一方面提供编码所述的重组抗原的核酸。

6、本申请另一方面还提供一种含有所述核酸的载体。

7、在其中一个实施例中，所述载体为pfastbac i或pet28a。

8、本申请另一方面还提供一种宿主细胞，其含有所述的核酸或所述的载体。

9、在其中一个实施例中，所述宿主细胞为昆虫细胞。

10、本申请另一方面还提供一种ama-m2重组抗原的制备方法，包括将所述的载体导入所述的宿主细胞。

11、在其中一个实施例中，导入宿主细胞后于36℃～38℃、180rpm～220rpm培养16h～20h后，离心收集产物。

12、本申请另一方面还提供所述的ama-m2重组抗原在制备诊断原发性胆汁性胆管炎或检测ama-m2产品中的应用。

13、本申请另一方面还提供一种诊断原发性胆汁性胆管炎的产品，所述产品采用所述的ama-m2重组抗原作为检测抗原。

14、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

15、本申请的ama-m2重组抗原通过2个重复的linker序列(eaaak)把pdc-e2和ogdc-e2以及bcoa-e2蛋白串联起来组成的融合蛋白，使得这三个蛋白即具备相对独立的空间构象，又增加了许多优势表位，很大程度上提高了灵敏度和信号值。

16、其次，本申请的重组抗原采取的昆虫杆状病毒表达系统进行重组表达，融合蛋白具备较成熟的翻译后修饰，对提高重组抗原的检出率有提升作用，使用本申请的重组抗原，制备原发性胆汁性胆管炎(pbc)抗体检测试剂盒，可有效提高试剂的灵敏度和特异性。

技术特征：

1.一种ama-m2重组抗原，其特征在于，所述重组抗原氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的ama-m2重组抗原，其特征在于，所述重组抗原c端连接有标签蛋白。

3.根据权利要求2所述的ama-m2重组抗原，其特征在于，所述标签蛋白为his、flag、ha、c-myc、avitag、snap或flag标签。

4.编码权利要求1～3任一项所述的重组抗原的核酸。

5.含有权利要求4所述核酸的载体；

6.宿主细胞，其含有权利要求4所述的核酸，或权利要求5所述的载体；

7.一种ama-m2重组抗原的制备方法，其特征在于，包括将权利要求5所述的载体导入权利要求6所述的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，导入宿主细胞后于36℃～38℃、180rpm～220rpm培养16h～20h后，离心收集产物。

9.权利要求1～3任一项所述的ama-m2重组抗原在制备诊断原发性胆汁性胆管炎或检测ama-m2产品中的应用。

10.一种诊断原发性胆汁性胆管炎的产品，其特征在于，所述产品采用权利要求1～3任一项所述的ama-m2重组抗原作为检测抗原。

技术总结
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种AMA‑M2重组抗原及其制备方法与应用。本申请的AMA‑M2重组抗原通过2个重复的linker序列(EAAAK)把PDC‑E2和OGDC‑E2以及BCOA‑E2蛋白串联起来组成的融合蛋白，使得这三个蛋白即具备相对独立的空间构象，又增加了许多优势表位，很大程度上提高了灵敏度和信号值。可选地，本申请的重组抗原采取的昆虫杆状病毒表达系统进行重组表达，融合蛋白具备较成熟的翻译后修饰，对提高重组抗原的检出率有提升作用，使用本申请的重组抗原，制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)抗体检测试剂盒，可有效提高试剂的灵敏度和特异性。

技术研发人员：刘滔滔,林晓涛,王刚,康雅虹,钱纯亘
受保护的技术使用者：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15