一种油茶SQS基因的克隆及表达载体构建的方法

本发明涉及生物工程，具体涉及一种油茶sqs基因的克隆及表达载体构建的方法。

背景技术：

0、技术背景

1、油茶(camelliaoleifera)是我国南方重要的木本油料，2019年我国油茶籽产量267.9万吨，茶油年产量65万吨，综合产值达千亿元。油茶种子中不仅富含油脂(约45％)和油酸(约75％)，而且特别含有100～700μg/g的角鲨烯，角鲨烯是一种开链三萜类化合物，是所有类固醇类物质的生物合成前体，研究表明，其具有抗氧化、清除人体自由基和增强免疫力等作用，长期食用茶油可有效预防心血管和肝脏疾病。角鲨烯应用广泛，近年来已有多篇文献报道了关于角鲨烯合成通路中的相关酶和关键基因的研究。

2、角鲨烯合成酶(squalene synthase,sqs)可催化异戊二烯途径中的碳流向三萜生物合成，sqs活性与角鲨烯等三萜化合物的产量相关，是角鲨烯等三萜类化合物合成过程中的关键酶。近年来已有研究对不同植物如人参、水稻、重楼等植物的sqs基因进行了克隆与载体构建，实现了在分子水平上探讨植物中三萜类化合物合成的机理和通过基因转化来探究基因表达的最佳条件。而目前对于油茶中sqs基因的克隆与载体构建的相关研究极少。

技术实现思路

1、为解决角鲨烯来源少、供不应求的情况，本发明从基因克隆和基因载体构建的分子角度探究角鲨烯在油茶种子中产生以及高积累的机制。目前本发明已完成油茶sqs基因的测序工作，通过生物信息学方法分析sqs基因编码蛋白的理化性质，并以不同品种油茶的种子为试验材料，研究发现多个不同品种油茶sqs基因表达量与油茶种子中积累的角鲨烯含量之间呈正相关关系。本发明在前期研究成果的基础上，进一步对油茶sqs基因进行克隆，构建植物转化载体，将载体转化至烟草，以实现从转化的植株中筛选得到高表达sqs基因及高含量的角鲨烯单株植株。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种油茶sqs基因的克隆及表达载体构建的方法，包括以下步骤：

4、(1)提取油茶rna，合成cdna并进行pcr扩增；

5、(2)构建油茶sqs基因的过表达载体；

6、(3)利用油茶sqs基因的过表达载体将重组产物转化至大肠杆菌dh5α细胞；

7、(4)将重组表达载体转化烟草；

8、(5)测定烟草种子中sqs基因的相对表达量和角鲨烯含量。

9、进一步的，步骤(2)具体为：表达载体构建的过程中，采用的酶切反应体系为2μl10×k buffer、5μl载体质粒、2μl bamhi、不多于40μl的ddh2o，重组反应试剂盒采用的是vazyme公司clonexpress-ii one step cloning kit，重组连接反应体系(总体积10μl)为4μl线性化载体、1μl插入片段、2μl 5×ce ii buffer、15μl exnase ii以及补足10μlddh2o。

10、进一步的，步骤(3)具体为：重组产物转化至大肠杆菌dh5α细胞过程中，在100μl大肠杆菌感受态细胞中加入10μl连接产物，反应条件为，冰浴30min；42℃热激60-90s；冰浴2min；加入800μl lb液体培养基，反应条件为，37℃摇床培养30min；6000rpm离心3min。

11、进一步的，步骤(4)转化烟草过程中使用的ms预培养固体培养基组成为：4.74g/lms培养基粉末、30g/l蔗糖、8g/l琼脂粉、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、0.1mg/lα.萘乙酸(naa)，ph6.0。

12、进一步的，步骤(4)：sqs基因表达载体转化至烟草过程中，使用的分化培养基组成为：4.74g/lms培养基粉末、30g/l蔗糖、8g/l琼脂粉、0.5mg/l 6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、0.1mg/lα/萘乙酸(naa)、50mg/l卡那霉素(kan)、500mg/l羧苄青霉素(car)，ph6.0。

13、油茶sqs基因的序列如下：

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39、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

40、本发明首次将油茶种子中的sqs基因克隆与构建表达载体的方法成功转化到烟草。并测定烟草种子中角鲨烯的含量和sqs基因的相对表达量。该方法首次从生物工程的角度去探究油茶种子中角鲨烯合成与积累的机制。