一种用于猴痘病毒检测的探针组合物及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种用于猴痘病毒检测的探针组合物及试剂盒。

背景技术：

1、猴痘（monkeypox，mp）是由猴痘病毒（mon-keypox virus，mpv）引起的一种人兽共患传染病。猴痘病毒是一种基因组长达200kb左右的dna病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，外形为回角砖形或卵圆形，大小为200~400nm，外被脂蛋白膜或封套，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链dna基因组。猴痘病毒的基因组为双链dna，长约197kb，基因组末端包含一个相同但方向相反的末端反向重复序列。该病毒包含190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中；同一属的病毒还包括天花病毒、牛痘病毒等。早在1958年，人们就发现一种痘病毒在实验猕猴中可引致一种类似于人天花的疾病，这种病被称为猴痘，该病毒也因此而得名猴痘病毒。

2、猴痘的临床表现类似于天花，但天花传染性更强，致死率 更高，死亡率约 30%。临床中猴痘需要与其他出疹性疾病相鉴别，如水痘、麻疹、细菌性皮肤感染、疥疮、梅毒和药疹等，主要根据流行病学接触史、发热与皮疹出现的时间间隔、皮疹形态、皮疹分布情况、以及病原学检查进行鉴别。猴痘在“非典型水痘”和不明原因皮疹患者中的发病率分别为7.3%和6.1%，猴痘可能由于皮损的区域性多形性和向心性分布而被误诊为水痘。疾病前驱期的淋巴结肿大可能是区分猴痘与水痘或天花的重要临床特征。

3、目前猴痘的传播途径尚未完全明确，可能主要通过直接接触受感染动物的血液、体液或皮肤或黏膜创口，发生动物对人（人畜共患）传播，食用未充分煮熟的受感染动物的肉类和其他制品也是一个可能的风险因素。二次传播或人际间传播可能是由于密切接触了感染者的呼吸道分泌物、损伤的皮肤粘膜或被污染的物品而造成。通过长时间面对面的接触可以导致经呼吸道飞沫传播，因此接触活动期患者的卫生工作者、家庭成员和其他密切接触者感染猴痘风险明显增加。人与人之间的传播是有限的，有记载的最长传播链为6代，这意味着在传播链中最后一个被感染的人与最初的患者相距6个环节，目前暂无证据提示猴痘会发生大面积的人际传播。在猴痘暴发期间，未接种疫苗的密切接触者中有 0%~11%可能成为临床病例，其中家庭接触者的继发率约为8%。

4、由于猴痘只能由实验室确诊，国际上尚无一种通用的、安全快速的对天花和猴痘病毒感染的血清4学诊断方法，而生物学鉴别诊断（病毒分离培养、电镜观察等）通常需3~6天，且存在生物安全危害隐患。由于血清学诊断与临床诊断的灵敏度不高，不易鉴别诊断天花、猴痘及其他出皮疹的疾病，所以采用分子诊断（pcr或荧光定量pcr）技术来进行病毒感染的快速特异诊断方法快速发展。而现有的分子诊断大多存在灵敏度不高等缺陷。因此，本领域需求一种灵敏度高的快速诊断猴痘病毒的产品，以便应对突发的猴痘疫情。

5、实时荧光pcr的优点在于对其整个pcr测定过程的实时监控，明确了指数扩增期，使得对起始模板的定量测定变得相对容易，而且测定范围大；测定敏感性高；测定准确度和重复性好；大大降低了实验室“污染”的可能性。

6、与传统pcr相比，实时荧光pcr也有一定的局限性：由于始终是“闭管”扩增及检测，无法检测扩增子大小；目前的实时荧光pcr仪都只有有限的荧光测定通道，使得多重实时pcr收到限制；特定的实时荧光pcr仪，可能只适用于特定的荧光染料；实时荧光pcr分析中，有时会得到非特异的扩增曲线，必须加以分析甄别，否则会因此而得到假阳性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于多重荧光实时定量pcr技术对猴痘病毒进行快速高效检测的探针组合物及试剂盒。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种用于猴痘病毒检测的探针组合物，所述组合物包括猴痘探针组合物以及内参探针组合物；

4、所述猴痘探针组合物包括猴痘检测探针以及检测引物对，所述内参探针组合物包括内参探针以及内参引物对；

5、所述猴痘检测探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述检测引物对的核苷酸序列如seq id no.2~3所示；

6、所述内参探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述内参引物对的核苷酸序列如seq id no.5~6所示。

7、进一步的，所述猴痘检测探针的5′端标记有报告基团fam，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1。

8、进一步的，所述内参探针的5′端标记有报告基团vic，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1。

9、进一步的，所述组合物的各成分以混合的形式存在。

10、一种上述用于猴痘病毒检测的探针组合物在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的应用。

11、一种包含上述用于猴痘病毒检测的探针组合物的试剂盒。

12、进一步的，所述试剂盒还包括premix ex taq，引物探针，ddh2o双蒸水，阳性对照品。

13、更进一步的，试剂盒中，premix ex taq为10 ul，引物探针为2 ul，ddh2o双蒸水为4 ul，体积（反应体系mix）为16 ul。

14、一种用于以非诊断目的检测猴痘病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

15、1）提取或释放待测样本的核酸；

16、2）使用上述探针组合物或如权利要求6中所述的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行多重荧光实时定量pcr分析；

17、3）获得并分析结果。

18、本发明的有益效果在于：本发明采用多重荧光实时定量pcr法，通过设计pcr引物和探针，利用taqman探针法的高度特异性，对猴痘病毒进行检测，结果表明，本发明的最低检出限为195copies/ml，检出率为95%，极大地提高检测猴痘病毒的效率。

技术特征：

1.一种用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述组合物包括猴痘探针组合物以及内参探针组合物；

2.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述猴痘检测探针的5′端标记有报告基团fam，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1。

3.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述内参探针的5′端标记有报告基团vic，3′端标记有荧光淬灭基团bhq1。

4.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。

5.一种如权利要求1~4任一项所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的应用。

6.一种包含如权利要求1~4任一项所述的用于猴痘病毒检测的探针组合物的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其还包括premix ex taq、引物探针、ddh2o双蒸水以及阳性对照品。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述premix ex taq为10 ul，引物探针为2 ul，ddh2o双蒸水为4 ul。

9.一种用于以非诊断目的检测猴痘病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种用于猴痘病毒检测的探针组合物，所述组合物包括猴痘探针组合物以及内参探针组合物；所述猴痘探针组合物包括猴痘检测探针以及检测引物对，所述内参探针组合物包括内参探针以及内参引物对；所述猴痘检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2~3所示；所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5~6所示。本发明同时公开了包含上述探针组合物的试剂盒。结果表明，本发明的最低检出限为195copies/ml，检出率为95%，极大地提高检测猴痘病毒的效率。

技术研发人员：陈江坡,胖铁良,黄仕艺,杜锦然,王冠楠,卢孟孟
受保护的技术使用者：廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14