一种齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记、检测引物、试剂盒及其用途的制作方法

本发明属于分子标记，具体涉及一种齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记、检测引物、试剂盒及其用途。

背景技术：

1、鱼类的性别决定、分化机制和性别连锁分子标记辅助育种技术的研究在水产养殖上具有直接的商业价值，因为包括生长速度和身体颜色在内的许多经济性状都具有性别二态性(mei and gui,2015)。在目前养殖的很多水产生物中，都能观察到雌雄之间显著的个体大小二态性。例如，在一些物种中，雌性比雄性长得更快，体型更大，包括半滑舌鳎(chenet al.,2007)和鲤鱼(cyprinus carpio)(wu and gui,1999)；相比之下，尼罗罗非鱼(mairet al.,1995)和黄鲶(pelteobagrus fulvidraco)(wang et al.,2009b)的雄性长得更快，体型更大。因此，单性鱼的筛选能极大提高水产养殖的效益，鉴定这些物种的性别特异性标记是水产养殖研究的重点。尽管鱼类在表型性状上普遍存在性二态性，但通过细胞学分析，大多数鱼类的性染色体是在形态上极为相似，难以区分。因此寻找与性别位点相关联的遗传标记是更为科学准确的方法(charlesworth et al.,2005)。

2、齐氏罗非鱼(coptodon zillii)隶属于丽鱼目、丽鱼科、齿非鲫属，原产于非洲至约旦河水系，1978年作为养殖品种引入我国。由于其环境适应性强，能耐污染和低氧环境，繁殖能力极强，生长迅速而成为常见的养殖品种。齐氏罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快，全雄化养殖可以明显提高齐氏罗非鱼的养殖效率(谢小军等，1994)。同时，超雄鱼和全雄鱼的获得则有助于基础研究。因此，开展齐氏罗非鱼遗传性别鉴定和性别控制技术研究既有重要的科学意义，又有广阔的应用前景。

3、齐氏罗非鱼染色体2n＝22，为xy型性染色体。由于鱼类性别的可塑性，一方面可以通过雄性类固醇激素、抗雌药物和芳香化酶(雌激素合成关键酶)抑制剂等处理，诱导遗传性别为xx的个体发育为伪雄鱼(遗传上仍为xx)，将xx伪雄鱼与正常xx雌鱼交配繁殖，最终获得全雌后代，实现齐氏罗非鱼全雌单性苗种培育。另一方面，通过雌激素和雄激素抑制剂的处理(sun et al.,2014)，诱导遗传性别为xy的个体发育为伪雌鱼(遗传上仍为xy)，将xy伪雌鱼与正常xy雄鱼交配繁殖，可获得yy超雄鱼，将yy超雄鱼雌性化处理，获得的yy伪雌鱼与正常xy雄鱼交配繁殖，可获得全雄鱼。传统的鱼类性控育种技术通过测交来判断亲本的基因型的方法，依赖鱼的生长周期，耗费时间；而基于性别连锁的分子标记，能够简单快速地鉴定遗传性别，大大节省人力物力。然而，目前尚没有在齐氏罗非鱼中开发分子标记的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记、检测引物、试剂盒及其用途，可以适用于实验室及不同流域的野生齐氏罗非鱼遗传性别的鉴定。并且，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼xx♀、正常雄鱼xy♂、转化雌鱼xy♀和yy♀、转化雄鱼xx♂和超雄鱼yy♂个体。此外，本技术还提供了基于上述分子标记快速高效生产全雄鱼的方法，以实现全雄鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益；目的之四在于提供一种基于上述分子标记快速高效生产全雄和超雄鱼的方法，以获得单性鱼苗应用于基础研究。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记，包括x染色体和y染色体特异分子标记；x染色体特异分子标记核苷酸序列如seq id no.1所示，y染色体特异分子标记核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、一种检测上述齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记的引物，引物序列如seq idno.3和seq id no.4所示，具体序列如下：

5、上游引物：5’-agttaatgtgttcctagtgtcc-3’；(seq id no.3)

6、下游引物：5’-gcctctgacatgctgaacat-3’。(seq id no.4)

7、进一步地，引物能扩增出长度为570bp的x染色体特异分子标记和长度为704bp的y染色体特异分子标记。

8、一种用于检测上述齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记的试剂盒，包括上述引物。

9、上述分子标记、引物，或试剂盒在齐氏罗非鱼育种中的用途。

10、一种鉴别齐氏罗非鱼遗传性别的方法，采用上述引物，或试剂盒对待测齐氏罗非鱼基因组进行扩增，然后将扩增所得片段与齐氏罗非鱼性染色体特异分子标记进行对比，确定其遗传性别。

11、进一步地，基于扩增片段的长度，确定待测齐氏罗非鱼的遗传性别，具体为：

12、当从待测齐氏罗非鱼的基因组dna中仅扩增出长度为570bp的x染色体特异分子标记时，判断该待测齐氏罗非鱼为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为xx；

13、当从待测齐氏罗非鱼的基因组dna中仅扩增出长度为704bp的y染色体特异分子标记时，判断该待测齐氏罗非鱼为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为yy；

14、当从待测齐氏罗非鱼的基因组dna中同时扩增出x染色体特异分子标记和y染色体特异分子标记时，判断该待测齐氏罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为xy。

15、一种培育全雌齐氏罗非鱼的方法，包括以下步骤：

16、(1)将齐氏罗非鱼xx雌鱼与xy雄鱼交配后产生的后代进行雄性化处理，再利用上述引物筛选出性染色体基因型为xx的转化雄鱼；

17、(2)将xx转化雄鱼与正常齐氏罗非鱼xx雌鱼交配，获得xx全雌鱼。

18、一种培育超雄和全雄齐氏罗非鱼的方法，包括以下步骤：

19、(1)将齐氏罗非鱼xx雌鱼与xy雄鱼交配后产生的后代进行雌性化处理，再利用上述引物筛选出性染色体基因型为xy的转化雌鱼；

20、(2)将xy转化雌鱼与齐氏罗非鱼xy雄鱼交配，利用上述引物从后代中筛选出性染色体基因型为yy的超雄鱼；另取xy转化雌鱼与齐氏罗非鱼xy雄鱼交配后代进行雌性化处理，利用上述引物筛选出性染色体基因型为xy和yy的转化雌鱼；

21、(3)将yy超雄鱼与xy或者yy的转化雌鱼交配，获得yy超雄鱼；

22、(4)将yy超雄鱼与xx正常雌鱼交配，获得xy全雄鱼。

23、本发明的有益效果：

24、本发明首次筛选到齐氏罗非鱼x和y染色体特异分子标记，建立了齐氏罗非鱼遗传性别pcr鉴定方法，并将本方法应用到全雄齐氏罗非鱼培育过程中的遗传性别鉴定。整个过程具有高效，准确和稳定的特点，在齐氏罗非鱼性别控制和全雄齐氏罗非鱼苗种的持续规模化生产中具有重要的应用价值。

25、本发明的齐氏罗非鱼x和y染色体特异分子标记，可适用于实验室及不同流域的野生齐氏罗非鱼；基于该分子标记构建的齐氏罗非鱼遗传性别鉴定方法，可以方便、快速、准确地区分正常雌鱼xx♀、正常雄鱼xy♂、转化雌鱼xy♀和yy♀、转化雄鱼xx♂和超雄鱼yy♂；基于上述遗传性别鉴定方法可以通过xx转化雄鱼♂与正常雌鱼xx♀交配实现全雌鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益；通过正常雌鱼xx♀与超雄鱼yy♂交配产生xy全雄鱼，转化雌鱼yy♀和超雄鱼yy♂交配产生yy超雄鱼，可获得大量单性鱼苗，从而应用于基础研究。