肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法与流程

本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及一种人类肝癌相关的血清microrna标志物及一种诊断肝癌的新方法，血清微核糖核酸microrna包含hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27、hsa-mir-4499。

背景技术：

1、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）是全球最常见的恶性肿瘤之一，世界卫生组织发布的数据显示，2020年全球癌症新发病例约1929万，死亡病例约996万。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重要原因之一，给社会带来了沉重的经济负担。肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，就全球而言，慢性hbv和hcv感染是原发性肝细胞癌（hcc）主要的危险因素，尤其是慢性hbv感染与hcc发病呈现高度的地域一致性，与全球75％的肝癌有关，在发展中国家甚至达到85％。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，。慢性乙型肝炎病毒（hbv）感染是我国肝癌的最主要病因。肝癌主要包括：肝细胞癌和肝内胆管细胞癌，前者占到83.9%～92.3%，而约85%的肝细胞癌患者都有hbv感染。我国肝癌5年相对生存率仅为12.1%，但是，如果早期诊断经过有效治疗，可达到相对较好的预后，尤其是5cm以内的小肝癌，5年生存率可达到80%以上。目前，肝癌筛查效果不理想，检出率和早期诊断率相对偏低，开发适用于广泛人群的早期筛查手段，对我国肝癌的有效防治意义重大。

2、肝癌早期无明显症状，传统早筛方法是针对高危人群进行肝癌血清学诊断标志物甲胎蛋白（afp）联合肝脏b超检查。甲胎蛋白作为应用最广的血清学标志物，在肝癌诊断和监测中发挥着重要作用，但是其对早期肝癌的检出率并不令人满意。目前国内外研究均证明，甲胎蛋白（afp）在特异性、敏感性仍然存在不足。临床存在约30%至40%的甲胎蛋白阴性患者。b超检测的灵敏度跟肿瘤的位置相关，而且对检查医生的技能要求较高，这些就造成了肝癌早期筛查、诊断的难度。

3、microrna（mirna）是一系列进化保守的长20～25个核苷酸的单链rna分子，属于内源性非编码rna。mirna通过和靶基因mrna的不完全互补配对，抑制蛋白的翻译表达过程或促使mrna的降解。mirna的调控机制复杂而多样化。通过调节靶基因的表达，mirna可以指导一系列生物学机制，如胚胎生长、细胞生长、凋亡以及细胞分化等。mirna作为肿瘤标志物具有以下五大优点：①mirna在正常人外周血中表达稳定且可以稳定存在，无显著的个体差异；②血清或血浆中mirna在室温下孵育24h及以上、反复冻融、过酸、过碱条件下不易降解；③mirna表达水平的变化与恶性肿瘤的病理过程密切相关；④血清中mirna的异常表达可作为肿瘤细胞存在的直接证据，具有很好的生物学标志物价值；⑤mirna相比于蛋白标志物不仅检测准确率更高，且更易于实现多组分同时检测，优越性明显。mirna参与人体许多细胞活动，如增生、凋亡及迁移等。而且，mirna在癌症的增殖、转移中具有重要作用，可将其作为肿瘤发生、发展及预后的生物标志物。

4、在前期的研究中，我司首次发现，与对照组相比，hsa-mir-2115和hsa-mir-4499在肝癌患者血清表达水平均具有显著的差异，调控肝癌细胞活性，对肝癌早期诊断有一定的指导作用，具有作为hcc早期诊断标志物的潜力。通过联合hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27和hsa-mir-4499，可以进一步的提高诊断效果，提升诊断价值，通过多个mirna生物标志物联合应用可以快速、准确、低成本的早期诊断hcc患者。

5、参考文献：[1] xu j , wu c , che x ,et al.circulating micrornas, mir-21, mir-122, and mir-223, in patients with hepatocellular carcinoma orchronic hepatitis.[j].molecular carcinogenesis, 2011(2):50.

6、[2] zuo d , chen l , liu x ,et al.combination of mir-125b and mir-27aenhances sensitivity and specificity of afp-based diagnosis of hepatocellularcarcinoma[j].tumor biology, 2016, 37(5):6539-6549. doi:10.1007/s13277-015-4545-1.

7、[3] wang c , hann h w , ye z ,et al.prospective evidence of acirculating microrna signature as a non-invasive marker of hepatocellularcarcinoma in hbv patients[j].oncotarget, 2017, 8(10):-. doi:10.18632/oncotarget.9429.

8、[4] shaker o , alhelf m , morcos g ,et al.mirna-101-1 and mirna-221expressions and their polymorphisms as biomarkers for early diagnosis ofhepatocellular carcinoma[j]. infection, genetics and evolution: journal ofmolecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases,2017, 51:173-181.doi:10.1016/j.meegid.2017.03.030.

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一组肝癌相关血清microrna标志物及一种诊断肝癌的新方法，可以进一步的提高肝癌诊断效果，提升诊断价值。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供的肝癌相关血清microrna标志物，其特征在于，肝癌相关血清microrna标志物由hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27和hsa-mir-4499构成；其中hsa-mir-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg（seq id no.1），hsa-mir-21的序列为tagcttatcagactgatgttga（seq id no.1），hsa-mir-2115的序列为catcagaattcatggaggctag（seq id no.3），hsa-mir-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc（seq id no.4），hsa-mir-27的序列为ttcacagtggctaagttccgc（seq id no.5），hsa-mir-4499的序列为gattgctctgcgtgcggaatcgac（seq id no.6）。

4、本发明一种诊断肝癌的新方法，其特征在于，待测血清采样处理后，用real-timepcr方法测量肝癌相关血清microrna标志物在血清中的相对表达量；对肝癌相关血清microrna标志物hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27和hsa-mir-4499进行检测的试剂，含有针对上述标志物的引物，具体构成如下：标志物hsa-mir-122（seq id no.1）的上游引物hsa-mir-122-f的序列为gccgagtggagtgtgacaatg（seqid no.7），标志物hsa-mir-21（seq id no.2）的上游引物hsa-mir-21-f的序列为tcggcaggtagcttatcagac（seq id no.8）；标志物hsa-mir-2115（seq id no.3）的上游引物hsa-mir-2115-f的序列为catcagaattcatggaggct（seq id no.9）；标志物hsa-mir-221（seqid no.4）的上游引物hsa-mir-221-f的序列为gccgagagctacattgtctgc（seq id no.10）；标志物hsa-mir-27（seq id no.5）的上游引物hsa-mir-27-f的序列为gccgagttcacagtggctaag（seq id no.11）；标志物hsa-mir-4499（seq id no.6）的上游引物hsa-mir-4499-f的序列为gattgctctgcgtgcggaatc（seq id no.12）；上述标志物的通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt （seq id no.13）。

5、本发明一种诊断肝癌的新方法，其特征在于，对肝癌相关血清microrna标志物hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27和hsa-mir-4499进行测量，测出δct值后输入判别公式：

6、综合判断值=-1.772+0.097*δct hsa-mir-122 +0.295*δct hsa-mir-21 -1.123*δct hsa-mir-2115 -0.322*δct hsa-mir-221 +0.606*δct hsa-mir-27 +0.057*δct hsa-mir-4499；综合判断值≥0，为阳性，患肝癌的风险较高；综合判断值＜0，为阴性，患肝癌的风险较低。

7、本发明肝癌相关血清microrna标志物，选自hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27和hsa-mir-4499中的多种。

8、为了方便检测使用，将肝癌相关血清microrna标志物测量所用到的试剂和工具制备成试剂盒，其中包含的试剂是能够测定这些血清microrna标志物在血清中表达量的，含有上述肝癌相关血清microrna标志物（hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27、hsa-mir-4499）的引物。具体实施如下：

9、一种人类肝癌诊断试剂盒，该试剂盒含有上述肝癌相关血清microrna标志物的引物，对应microrna标志物hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27、hsa-mir-4499的测量试剂分别含有上游引物和下游引物，6对引物具体如下：

10、标志物hsa-mir-122（seq id no.1）的上游引物hsa-mir-122-f的序列为gccgagtggagtgtgacaatg（seq id no.7），通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）；

11、标志物hsa-mir-21（seq id no.2）的上游引物hsa-mir-21-f的序列为tcggcaggtagcttatcagac（seq id no.8），通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）；

12、标志物hsa-mir-2115（seq id no.3）的上游引物hsa-mir-2115-f的序列为catcagaattcatggaggct（seq id no.9），通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）；

13、标志物hsa-mir-221（seq id no.4）的上游引物hsa-mir-221-f的序列为gccgagagctacattgtctgc（seq id no.10），通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）；

14、标志物hsa-mir-27（seq id no.5）的上游引物hsa-mir-27-f的序列为gccgagttcacagtggctaag（seq id no.11），通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）；

15、标志物hsa-mir-4499（seq id no.6）的上游引物hsa-mir-4499-f的序列为gattgctctgcgtgcggaatc（seq id no.12），通用下游引物universal rp序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）。

16、试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。

17、本发明人以标准操作程序（sop）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了rt-pcr方法、taqman mirna array、real-time pcr（taqman探针）方法的多种进行检测。

18、具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

19、一、研究对象选择和分组依据

20、a组：对照组（n=345，150例健康对照，150例慢性乙肝患者，145例肝硬化患者），无其他全身性重大疾病；

21、b组：肝癌患者（n=233），无其他全身性重大疾病。

22、二、血液血清分离及前处理

23、（1）抽取外周血（2ml）放入分离胶采血管中，轻轻地180°上下颠倒混匀，持续5-6次，12小时内，将促凝采血管在3,000g条件下离心10分钟。然后，随后将上清液转移到干净的管中，在-80℃储存；

24、（2）用mirneasy血清/血浆升级版试剂盒（mirneasy serum/plasma advancedkit），按照厂家（qiagen）提供的使用说明来抽提总rna，用qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度。

25、三、real-time pcr方法测量血清mirnas表达量

26、1. 取经前处理的血清，通过rna逆转录反应得到cdna样品；按下表所示配制反转录体系 ：

27、 成分 体积（μl） 10×poly（a）polymerase buffer 2 e.coli poly（a）polymerase（5u/μl） 0.5 atp（10mm） 1 dntp mix（10μm） 1 hiscript ⅱ reverse transcriptase（200u/μl） 1 rnase inhibitor（40μm） 1 rt primer universal（5μm） 1 rna 10 <![cdata[rnase-free ddh₂o]]> 2.5 合计 20

28、2. 将pcr管反复颠倒混匀8次后做简短离心，冰上放置3分钟。

29、3. 将pcr管放入基因扩增仪进行反转录，反应条件如下 ：

30、42℃，60min；85℃，5min；4℃，forever；

31、反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。

32、4. 逆转录之后的cdna按下表反应体系配制进行预扩增 ：

33、 成分 体积（μl） 预扩增混合液（2×） 12.5 预扩增引物（10×） 2.5 反转录产物 2.5 <![cdata[rnase-free ddh₂o]]> 7.5 合计 25

34、预扩增的反应条件如下表所示 ：

35、

36、降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃以用于下一步的real-time pcr反应。

37、5. 将预扩增产物简短离心后，加入0.1×te(ph8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的real-time pcr。

38、预扩增产物进行real-time pcr按下表所示配制反应体系 ：

39、 成分 一块芯片所需体积（μl） 通用pcr混合物（2×） 400 稀释后的预扩增产物 8 <![cdata[rnase-free ddh₂o]]> 392 合计 800

40、6. 检测并比较健康对照组、肝癌患者血清样本中mirnas表达量的差异。

41、检测到的存在差异表达的对照组和肝癌患者血清mirnas包括hsa-mir-107、hsa-mir-122、hsa-mir-1246、hsa-mir-192、hsa-mir-199、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-223、hsa-mir-26、hsa-mir-27、hsa-mir-4499和hsa-mir-801。

42、这些mirnas在肝癌患者中的拷贝数都显著高于对照组。

43、四、在训练集中使用real-time pcr方法验证血清mirnas表达量

44、1. 设计13条目标mirnas的引物：运用加polya尾pcr方法设计引物。

45、2. 加入荧光探针进行real-time pcr反应。检测并对比健康对照组、慢乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者血清样本中mirnas表达量的差异（68例健康对照、62例慢性乙肝患者、61例肝硬化患者和101例肝癌患者）。

46、3. 经过real-time pcr检测，结果一致的有6条mirnas（简称：6mirna），具体为：hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27、hsa-mir-4499。

47、因此，最终确认为存在差异表达的健康对照组、肝癌患者血清mirnas包括hsa-mir-122（seq id no.1）、hsa-mir-21（seq id no.2）、hsa-mir-2115（seq id no.3）、hsa-mir-221（seq id no.4）、hsa-mir-27（seq id no.5）、hsa-mir-4499（seq id no.6）。

48、将以上存在表达差异显著的mirnas纳入logistics回归方程，得到：logit（p＝hcc）=-1.772+0.097*hsa-mir-122 +0.295*hsa-mir-21 -1.123*hsa-mir-2115 -0.322*hsa-mir-221 +0.606*hsa-mir-27 +0.057*hsa-mir-4499。

49、五、在验证集中评估上述mirnas组合的性能

50、在298例独立血清样本（70例健康对照、65例慢性乙肝患者、63例肝硬化患者和100例肝癌患者）中验证6mirna组合的性能，以评估6mirna组合预测肝癌患者的能力。

51、六、诊断试剂盒制备方法

52、根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于人类肝癌microrna诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血清中可检测的成熟hsa-mir-122、hsa-mir-21、hsa-mir-2115、hsa-mir-221、hsa-mir-27、hsa-mir-4499的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清mirnas引物，还可以包括taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。