一种PML/RARA融合基因的检测方法

本发明涉及基因检测领域，确切地说是一种pml/rara融合基因的检测方法。

背景技术：

1、急性早幼粒细胞白血病(apl)是急性髓性白血病(aml)的一个独特亚型，是一种高度侵袭性疾病，由于其特征性凝血功能障碍而表现为严重的出血综合征。apl的特点是染色体特异性重排t(15；17)(q22；q21)，导致第17号染色体维甲酸受体α基因(rara)与第15号染色体早幼粒细胞白血病基因(pml)融合，进而产生致癌性pml/rara融合蛋白。病理上，pml基因通过调节细胞增殖和凋亡发挥肿瘤抑制作用，而rara基因编码一种核受体，控制参与分化、凋亡和颗粒形成的基因的转录。pml/rara融合基因产物可以破坏pml核小体(nbs)，抑制rara-rxr转录网络，从而阻碍dna的损伤反应、衰老和细胞凋亡。这导致造血干细胞在早幼粒细胞阶段的阻滞和自噬和凋亡的损害。根据pml断点的位置(通常位于内含子6、外显子6或内含子3)，可以产生不同的pml/rara亚型，包括长型(bcr1)、变异型(bcr2)和短型(bcr3)。在所有apl阳性病例中，bcr1占比45-55％，表明其在apl中普遍存在。因此，pml/rara基因组片段中bcr1亚型的鉴定和分类，对了解apl的特征起着至关重要的作用，对apl预后、风险分层和精准医疗更具有重要意义。

2、一般来说，检测pml/rara融合基因常用的方法有染色体分析、荧光原位杂交(fish)、流式细胞术(fcm)、实时定量逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)等。尽管染色体分析可以识别单细胞结构和数量上的异常，但它是一个耗时和资源密集型的过程，灵敏度低，不适合快速诊断。rt-pcr被认为是apl遗传确认的金标准，因为它能够高度敏感地识别特定的pml/rara亚型。然而，这种方法检测到的这些基因的表达水平可能并不能准确反映它们在所有apl细胞中的比例。尽管fish分析可以通过定量治疗过程中所需的异常信号来确定携带融合基因的细胞比例，但其准确性受到固定过程的限制，并且在有限数量的体内样本中快速定量痕量生物标志物可能不那么有效。fcm只能在单细胞水平上提供有关细胞形状、大小和荧光特征的信息，它在准确定量痕量生物标志物方面也有类似的局限性，可能无法提供全面的遗传信息。此外，这些方法耗时，昂贵，技术要求高，通常需要一到两天的时间才能得到结果。apl的及时诊断对于实施靶向治疗和优化患者预后至关重要。考虑到全反式维甲酸(atra)和三氧化二砷(aso3)治疗对pml-rara融合基因患者的高疗效，这一点尤为重要。然而，目前的诊断平台在从有限数量的体内样本中准确量化痕量生物标志物的能力上是有限的，这阻碍了及时缓解症状和个性化治疗的发展。因此，迫切需要开发一种新的、快速、有效的检测pml/rara融合基因的方法。

3、近年来，rna引导的crispr/cas(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/crispr associated nucleases)系统因其高效、快速的精确核酸检测而备受关注。在已发现的与crispr相关的cas蛋白中，cas12a是一种2型v-a型crispr相关酶，在crispr rna(crrna)存在下特异性切割目标双链dna(dsdna)或单链dna(ssdna)。同时，cas12a表现出反式切割活性，导致附近单链非靶向核酸被不加区分地随机切割。通过诱导荧光报告核酸(ssdna-fq)被非特异性的反式切割，这种切割活性被用于特异性靶基因的体外检测，进而导致荧光信号的增加。至关重要的是，由于其固有的低表达水平，核酸检测需要结合信号转导和核酸扩增技术。cas12a已与核酸扩增方法(如聚合酶链反应(pcr))和等温扩增方法(如链位移扩增(sda)、滚环扩增(rca)和环介导等温扩增(lamp)20-23)结合使用，以开发成本效益高、通用且高效的核酸检测系统和生物标志物诊断策略。特别是rca，已成为一种严格且高度特异性的等温基因扩增方法。它需要引物和环状dna模板之间的完全互补才能启动，这有利于单核苷酸多态性分析。因此，crispr/cas12a技术与rca技术的整合对于开发高效的多路等温核酸检测平台具有显著的优势。

4、通常，在涉及cas12a蛋白、crrna和ssdna-fq的反应中，它们的相互作用依赖于反应物之间的随机接触。根据碰撞理论，增加局部反应物浓度会促进分子频繁碰撞，从而提高反应效率和动力学。然而，以往的研究忽略了这一点。分子间g四链体(inter-g-quadruplex)是一种独特的dna序列，具有四链体结构，在分子生物学、生物医学和分析化学中显示出巨大的潜力。在这种结构中，四个鸟嘌呤碱基(g碱基)通过hoogsteen氢键连接形成一个鸟嘌呤四聚体，然后与两个或更多其他鸟嘌呤四聚体堆叠，形成一个g四链体。受其结构特性的启发，分子间g四链体可以作为一个支架来限制反应物，增加crispr/cas12a蛋白的局部浓度，从而提高反应效率和动力学，以便及时诊断疾病和生物医学研究。

5、基于以上考虑，本研究利用分子间g四链体的结构功能所产生空间约束效应加速激活crispr/cas12a系统，并将该平台应用于pml/rara融合基因bcr1异构体的超灵敏检测。我们使用rca作为分析工具来扩增目标基因，并引入一个缺口位点来产生具有多个串联g束的ssdna。扩增的ssdna通过hoogsteen氢键结合，形成分子间g四链体，有利于捕获crrna并与cas12蛋白结合。分子间g四链体的空间约束效应极大地增强了crispr/cas12a系统的局部浓度，使得荧光基团和猝灭基团修饰的ssdna-fq能够快速、非特异性地切割。据我们所知，这是第一次尝试利用分子间g四链体来创造空间限制效果以加速激活crispr/cas12a系统。我们的结果表明，通过遵循这种方法，目标基因可以精准快速的被定性和定量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种pml/rara融合基因的检测方法。

2、上述目的通过以下方案实现：

3、一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、(1)crrna的制备

5、通过体外转录合成crrna；

6、(2)将4μl双蒸馏水ddh2o、2μl的2μm锁式探针pp、2μl的2μm bcr1、1μl浓度为5u/μl的t4 dna连接酶和1μl 10×t4连接缓冲液在15-17℃下孵育25-35分钟，进行结环反应，形成环型探针pp；

7、(3)将2μm引物2μl、浓度为5u/μl的klenow片段聚合酶1μl、10×nebuffer 2反应缓冲液2μl、浓度为10u/μl的nt.bbvci 1μl、10×cutsmart 2μl、25mm的dntps2μl混合均匀，配制成10μl的混合物，再将10μl的环型探针pp作为dna模板加入到混合物中，进行rca扩增，将得到的20μl的扩增混合物混36-38℃孵育1-1.5小时，在64-66℃下10-12分钟使酶灭活；

8、(3)将8μl 1μm cas12a、8μl 1μm crrna、5μl 10×reaction buffer、1μl rnaseinhibitor 40u/μl的混合物在24-26℃下孵育10-12分钟，然后将22μl的混合物与2μl的10μm ssdna-fq和6μl的ddh2o混合，37-38℃孵育1.8-2.2小时,得处理后cas12a反应体系的样品备用；

9、(4)最后，将步骤(3)所得50μl处理后得样品加入150μl的ddh2o中，转移到微量比色皿中进行荧光检测和记录。

10、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：在基因序列表内，所述的所有单链dna的最终浓度都是根据200μl溶液的总体积来确定的，在生物传感方面，使用523nm处的荧光强度来评估靶目标物存在和不存在时的检测性能。

11、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

12、本实验使用perkinelmer fl8500荧光分光光度计waltham,usa进行所有荧光测量；仪器设置为:激发波长440nm，狭缝宽度10/10nm，扫描速度240nm/min，记录范围460-650nm,pmt探测器电压650v。

13、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：电泳实验采用servicebio pw-600电泳分析仪，凝胶成像照片采用champgel 7000凝胶成像系统，缓冲液的ph值使用leici ph-3e台式ph计测量，此外，bio-rad t100热循环系统用于控制恒定的反应温度。

14、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

15、步骤(1)的crrna的制备方法为：为了制备crrna，在tap dna聚合酶的参与下，以短t7引物t7-crrna-f和长t7引物t7-crrna-r为底物生成crrna模板dna；dna模板在94-96℃时进行热变性，然后逐渐冷却到环境温度退火；随后，在50μl的转录系统中，将200ng模板dna与5μl的1μm的t7 rna聚合酶、10μl的5×t7转录缓冲液和2μl的100mm ntps结合，加入rnaseinhibitor 40u/μl，36-38℃孵育8-10小时，然后，加入4μl体积浓度为1u/μl的dnase i和10×6μl体积的reaction buffer，然后将所得产物保存在-80℃左右备用即得。

16、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

17、本方法荧光检测中当靶目标bcr1不存在的情况下检测不到荧光信号，靶目标bcr1存在的情况下才有信号。

18、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

19、bcr1浓度在1fm-100pm范围内，523nm波长处的峰值荧光值f523与bcr1浓度cbcr1的对数之间呈线性关系，拟合方程为f523＝2974.4lgcbcr1+23781.8，其中相关系数r2＝0.9918，其最低检测限lod为0.86fm。

20、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

21、bcr1浓度在10nm-250nm范围内，523nm波长处的峰值荧光值f523与bcr1浓度cbcr1的对数之间呈线性关系，拟合方程为f523＝113.7lgcbcr1)+42787.7，其中相关系数r2＝0.9923。

22、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

23、对于靶目标bcr1具有极高的特异性，可以准确快速地区分野生型和其他典型pml/rara亚型，如bcr2,bcr3,pml-l,pml-s,pml-v。

24、所述的一种pml/rara融合基因的检测方法，其特征在于：

25、在含有1％人血清的环境中，bcr1浓度在50fm-50nm范围内，523nm波长处的峰值荧光值f523与bcr1浓度cbcr1的对数之间呈线性关系，拟合方程为f523＝4342.9lgcbcr1+24369.2，其中相关系数r2＝0.9911，可用于检测真实样本中的靶基因。

26、本发明的有益效果为：

27、(1)为了证明分子间g四链体在融合基因检测中的空间约束效应，我们设计了一个切割后触发类似物(nta)和一系列切割触发变体(ntv)，包括ntv1、ntv2和ntv3，它们被替换了不同数量的g碱基。这些变体被用来强调基于分子间g四链体的空间限制对cas12a切割效率的增强。硫黄素t(tht)的荧光可以通过其诱导、稳定和结合特性有效地指示分子间g四链体的存在。为了验证分子间g四链体的存在，将含有5μl 10μm nta或ntv的反应混合物(200μl)与含有1μm tht的tris缓冲液(50mm,ph 7.4,100mm nacl)195μl在37℃下孵育1小时。随后，测量了激发波长为430nm和发射波长为496nm的荧光强度。此外，在体外cas12a酶切ssdna-fq的整个过程中，采用bio-rad cfx connect real-time pcr系统(california,usa)进行实时荧光监测。这种监测使我们能够基于分子间g四链体的空间限制施加的空间约束来评估其对cas12a活性的加速。

28、(2)pml/rara基因组片段的三种亚型的准确检测和分类对于预测急性早幼粒细胞白血病(apl)的疾病进展、风险分层和给予精确的药物治疗至关重要。在这项研究中，我们开发了一种高度特异性的核酸检测平台，能够在等温条件下定量pml-rara三种主要亚型中的长型。该平台整合了crispr/cas12a核酸酶方法和滚环扩增(rca)技术的优势。值得注意的是，rca辅助的crispr/cas12a反式切割系统通过利用了分子间g四链体结构的空间限制效应。这种创新设计有效地提高了crispr/cas12a的局部浓度，从而加快了其对荧光报告核酸的切割效率，使pml/rara融合基因表达的荧光光谱的高效率检测成为可能。通过从人血清样本中检测pml/rara融合基因，验证了该检测平台在apl病例筛查、诊断和预后方面的可靠性和实际应用潜力。我们的研究结果为检测融合基因提供了一种简单、省时、高灵敏度的方法，为apl的快速诊断提供了一种有希望的方法，可以很容易地应用于临床诊断。