一种制备D-塔格糖工程菌的构建方法与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法。

背景技术：

1、d-塔格糖是自然界存量较少的一种六碳单糖，是d-半乳糖的同分异构体，具有低能量、降血糖、改善肠道菌群、抗龋齿等功效，在食品领域具有广阔的应用前景。目前生产塔格糖的方法主要有化学合成法和生物转化法，随着环保意识的增强，生物转化法将会逐步取代化学合成法，然而现在生产塔格糖的生物合成法大多为多酶复合体转化法，或者使用成本较高的乳糖作为原料来生产塔格糖，这样不利于推进工业化生产，所以寻求一种单酶单步转化就显得尤为重要。根据报道，d-塔格糖-二磷酸醛缩酶能将果糖单步转化为d-塔格糖，但是转化效率不高，原料利用率低，提高了生产成本。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，塔格糖的转化率高，转化步骤少，生产成本低。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

3、a：获取目的基因pcr引物f1和r1，所述f1为seq id no：3所示的核苷酸序列，具体为ggaattcatgaaaaagcaccccctac，所述r1为seq id no：4所示的核苷酸序列，具体为ccaatgcattggttctgcagttagcattccggatgggt；

4、b：对载体pyb1s和d-塔格糖-二磷酸醛缩酶的pcr产物进行ecori/psti双酶切，获得d-塔格糖-二磷酸醛缩酶pcr产物片段、pyb1s载体片段，所述d-塔格糖-二磷酸醛缩酶为seq id no：1所示的基因序列，d-塔格糖-二磷酸醛缩酶具有seq id no：2所示的氨基酸序列；

5、c：d-塔格糖-二磷酸醛缩酶pcr产物片段和pyb1s载体片段进行酶连，得重组质粒，并转化dh5α感受态，培养，得菌株，命名为bw25113-wt；

6、d：以上述重组质粒为模板，分别在位点y364a、v367n和y364a/v367n采用突变引物进行pcr扩增反应，并经dpni消化模板和转化dh5α感受态，培养，得制备d-塔格糖工程菌，分别命名为bw25113-y364a、bw25113-v367n和bw25113-y364a/v367n，其中位点y364a的突变引物为f2和r2,所述f2为seq id no：5所示的核苷酸序列，具体为gaccgcctgcgcgcgtactgggttt，所述r2为seq idno：6所示的核苷酸序列，具体为aaacccagtacgcgcgcaggcggtc；位点y367n的突变引物为f3和r3,所述f3为seq id no：7所示的核苷酸序列，具体为gctattactggnnkttgccggaagt，所述r3为seq id no：8所示的核苷酸序列，具体为ttccggcaannkccagtaatagcgc，位点y364a/v367n的突变引物为f4和r4,所述f4为seq id no：9所示的核苷酸序列，具体为ccgcctgcgcgcgtactggaacttgccggaagt，所述r4为seq id no：10所示的核苷酸序列，具体为gaacttccggcaagttccagtacgcgcgcaggcggt。

7、优选的，步骤c中转化条件为：d-塔格糖-二磷酸醛缩酶pcr产物片段和pyb1s载体片段酶连后加入dh5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min。

8、优选的，步骤c中的培养条件为转化产物加入lb液体培养基，涂布于lb平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。

9、优选的，步骤d中pcr扩增反应条件为：98℃预变性3min；然后98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，循环32次；补齐，72℃延伸10min。

10、优选的，步骤d中转化条件为：pcr扩增反应产物经dpni消化模板后加入dh5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min。

11、优选的，步骤d中的培养条件为pcr扩增反应产物经dpni消化模板和转化dh5α感受态后加入lb液体培养基，涂布于lb平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。

12、由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

13、1、对d-塔格糖-二磷酸醛缩酶基因进行密码子优化，关键氨基酸位点y364a、v367n和y364a/v367n突变，bw25113-y364a使塔格糖转化率提高了8.37％，bw25113-v367n使塔格糖转化率提高了2.2％，bw25113-y364a/v367n使塔格糖转化率提高了4.51％。

14、2、得到的制备d-塔格糖工程菌可进行全细胞转化，转化后易于分离。

15、3、得到的制备d-塔格糖工程菌稳定，可以重复利用5次以上，降低了塔格糖生产成本。

技术特征：

1.一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于，步骤c中转化条件为：d-塔格糖-二磷酸醛缩酶pcr产物片段和pyb1s载体片段酶连后加入dh5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min。

3.如权利要求1所述的一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于，步骤c中的培养条件为转化产物加入lb液体培养基，涂布于lb平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。

4.如权利要求1所述的一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于，步骤d中pcr扩增反应条件为：98℃预变性3min；然后98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，循环32次；补齐，72℃延伸10min。

5.如权利要求1所述的一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于，步骤d中转化条件为：pcr扩增反应产物经dpni消化模板后加入dh5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min。

6.如权利要求1所述的一种制备d-塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于，步骤d中的培养条件为：pcr扩增反应产物经dpni消化模板和转化dh5α感受态后加入lb液体培养基，涂布于lb平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。

技术总结
本发明公开了一种制备D‑塔格糖工程菌的构建方法，涉及基因工程技术领域，首先对位点WT进行定点突变为丙氨酸，然后进行饱和突变，PCR突变反应后DnpI处理、LB培养，挑单克隆进行诱导表达，对表达后的菌株通过转化实验检测塔格糖转化率，筛选到BW25113‑Y364A使塔格糖转化率提高了8.37％，BW25113‑V367N使塔格糖转化率提高了2.2％，BW25113‑Y364A/V367N使塔格糖转化率提高了4.51％，并且实现了全细胞转化，实验结果表明，菌体重复＞5次，转化率仍保持在27％。转化步骤少，全细胞转化易分离，菌体可以重复使用，原料成本低，这都为工业化生产奠定了坚实的基础。

技术研发人员：朱理平,徐良平,申莹莹,陈科材
受保护的技术使用者：东台市浩瑞生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15