DNA聚合酶的末端修复保真度检测方法及试剂盒与流程

本申请涉及dna测序，特别是涉及一种dna聚合酶保真度的检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、现有dna测序技术进行dna测序采样时，主要采集人体外周血内的游离dna片段(cell free dna，cfdna)，cfdna由细胞裂解产生而游离在外周血内，通过采集、探针筛选等方式获得目标片段。由于cfdna由细胞裂解产生，因而cfdna片段大多数残缺不全，筛选获得的片段通常为具有双链结构、但双链的长度不一致。对该类dna序列进行测序需要进行补齐后建库，具体过程如图1所示，包括以下步骤：

2、一、补齐，在反应环境中加入缓冲液、酶、dntp等反应物及催化物，使dna的双链呈反向互补，dna双链补齐后两端为平末端或粘性末端。

3、二、加接头，补齐后的dna片段的两端加上接头，以便对dna片段进行标记和测序引物结合等。

4、三、扩增，将目标dna进行大量复制以便进行测序。

5、补齐和扩增均是以其中的一条链作为模板，由引物或者短链开始，根据碱基互补配队的方式沿模板延伸，生成完成或新的dna链。延伸的过程中会产生错误，如模板处某位置的碱基为g，则延伸至该位置的正确的碱基应为c，而实际检测到的该位置的碱基为a，即为延伸错误。如前述的，补齐cfdna时，同样会在补齐区段出现错误，在进行生物信息学分析时，需要将补齐时出现的错误考虑在内。然而就实验室环境而言，末端修复时错误与使用的酶有关，酶的种类、浓度不同，延伸的错误率不同。且生产厂商会不断迭代优化产品，不同生产批次的同类的酶其错误率也有差别。产商在销售该类用于催化dna链延伸的酶时，并没有相应参数，目前也暂无验证该参数的验证方法。

技术实现思路

1、本发明提出一种dna聚合酶末端修复保真度检测方法及试剂盒，用于检测在进行末端修复时，dna聚合酶的末端修复保真度。

2、本发明通过以下技术方案实现的：

3、一种dna聚合酶末端修复保真度的检测方法，包括：

4、获取补齐及扩增后的序列样本中补齐区段的测序结果；

5、基于所述测序结果，获取有效序列；

6、基于所述有效序列，获取所述有效序列中总错误量及测序错误量；

7、基于所述总错误量及所述测序错误量计算待检测dna聚合酶的末端修复保真度。

8、进一步的，所述基于所述测序结果，获取有效序列，包括：

9、获取所述测序结果中，所述补齐区段的正义链及反义链相同位点的q值均不小于预设值的第一测序结果；

10、基于所述第一测序结果获取所述有效序列。

11、进一步的，所述基于所述第一测序结果获取所述有效序列，包括：

12、获取所述第一测序结果中正义链与反义链相同位点的碱基为互补配对的第二测序结果，并将所述第二测序结果作为所述有效序列。

13、进一步的，基于所述有效序列，获取所述有效序列中总错误量及测序错误量，包括：

14、统计所述有效序列的有效数量；

15、获取所述预设值，基于所述预设值及所述有效数量，计算所述测序错误量；

16、统计所述序列样本与所述有效序列的相同位点碱基不一致的数量为所述总错误量。

17、进一步的，所述基于所述总错误量及测序错误量计算待检测酶的保真度，包括：

18、基于所述总错误量及所述测序错误量计算所述补齐区段的修复错误率；

19、基于所述修复错误率计算所述待检测dna聚合酶的末端修复保真度。

20、进一步的，所述序列样本包括：第一链和第二链，由指定位点至3’端的区段呈反向互补，且两条单链的指定位点至5’端的区段呈单链。

21、进一步的，所述序列样本的扩增方法为桥式pcr扩增。

22、进一步的，所述预设值为30至40。

23、一种dna聚合酶的末端修复保真度检测的试剂盒，包括：

24、缓冲液、待检测dna聚合酶混合液、dna连接酶、测序接头、引物及上述序列样本；引物包括扩增引物及测序引物；序列样本的补齐区段在待检测dna聚合酶混合液作用下能够补齐及扩增。

25、进一步的，序列样本包括两条单链由指定位点至3’端的区段呈反向互补，且两条单链的指定位点至5’端的区段呈单链。

26、本发明的有益效果在于：

27、本申请对扩增后补齐区段的测序结果进行数据筛选以获取有效序列，通过数据筛选删除扩增时产生的错误，减少扩增错误对末端修复错误率的影响；

28、同时，根据从有效序列获取的总错误量和测序错误量计算dna聚合酶作用引起的扩增区域的修复错误，减少测序错误数据对末端修复错误率的影响；

29、本申请将总错误率中的扩增错误及测序错误排除，增加对末端修复错误率判断的准确性。

技术特征：

1.一种dna聚合酶的末端修复保真度的检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基于所述测序结果，获取有效序列，包括：

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述基于所述第一测序结果获取所述有效序列，包括：

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，基于所述有效序列，获取所述有效序列中总错误量及测序错误量，包括：

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基于总错误量及测序错误量计算待检测酶的保真度，包括：

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述序列样本包括：第一链和第二链，由指定位点至3’端的区段呈反向互补，且两条单链的指定位点至5’端的区段呈单链。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述序列样本的扩增方法为桥式pcr扩增。

8.根据权利要求2或4所述的检测方法，其特征在于，所述预设值为30至40。

9.一种dna聚合酶的末端修复保真度检测的试剂盒，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述序列样本包括两条单链由指定位点至3’端的区段呈反向互补，且两条单链的指定位点至5’端的区段呈单链。

技术总结
本发明公开了一种DNA聚合酶的末端修复保真度的检测方法及试剂盒。所述的检测方法包括获取序列样本中扩增区域的测序结果；通过对测序结果的筛选获取有效序列；基于有效序列，获取有效序列中的总错误量及测序错误量，并计算待检测DNA聚合酶的末端修复保真度。本申请对扩增后补齐区段的测序结果进行数据筛选以获取有效序列，通过数据筛选删除扩增和测序错误量对计算DNA聚合酶末端修复错误的影响，增加对末端修复错误率判断的准确性。

技术研发人员：程云阳,操利超,张核子,卢晓萍,沈嘉怡,翁琦,李雪玲,陈莹莹,余晨笛,吴敏
受保护的技术使用者：深圳核子华曦医学检验实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15