DNA聚合酶的扩增保真度的检测方法及试剂盒与流程

本申请涉及dna测序，特别是涉及dna聚合酶的扩增保真度的检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、现有dna测序技术在进行测序时，需要对样本进行扩增，以增加测序的深度；同时需要对样本的两端增加接头，以便标记dna片段、测序引物与dna片段结合，即dna片段建库工作。扩增是将变性后的dna双链作为模板，由引物开始，在dna聚合酶的催化下，根据碱基互补配队的方式沿模板延伸，形成新的dna链。延伸的过程中会产生错误，如模板处某位置的碱基为g，则延伸至该位置的正确的碱基应为c，而实际检测到的该位置的碱基为a，即为延伸错误。

2、如上述的，在建库的过程中，由于dna聚合酶在实验环境下会产生延伸错误，在建库的过程中即表现为扩增错误。在实际应用中，首选扩增错误率较低的(或保真度较高)的dna聚合酶，以减少数据分析过程的难度、增加测序数据的可信度。然而就目前而言，末端修复时保真度与使用的酶有关，酶的种类、浓度不同，延伸的错误率不同。且生产厂商会不断迭代优化产品，不同生产批次的同类的酶其错误率也有差别。产商在销售该类用于催化dna链延伸的酶时，并没有相应参数，目前也暂无验证该参数的验证方法。

技术实现思路

1、本发明提出一种dna聚合酶末端修复保真度检测方法及试剂盒，用于检测在进行末端修复时，dna聚合酶的保真度。

2、本发明通过以下技术方案实现的：

3、一种dna聚合酶的扩增保真度的检测方法，包括：

4、基于扩增参数扩增序列样本，并获取扩增后的测序结果及测序总量；

5、基于预设值、所述测序结果及所述测序总量，获取有效序列及有效数据量；

6、基于所述有效序列和所述序列样本，获取所述有效数据量中的有效总错误量和测序错误量；

7、基于所述测序总量、所述有效数据量、有效总错误量及测序错误量，获取dna聚合酶的扩增保真度。

8、进一步的，所述扩增参数包括：所述序列样本的初始样本量、扩增效率及扩增轮数，获取所述测序结果的测序总量。

9、进一步的，所述基于测序结果及测序总量，获取有效序列及有效数据量包括：

10、获取所述测序结果中，正义链及反义链相同位点的q值均不小于预设值的第一测序结果；

11、基于所述第一测序结果获取所述有效序列。

12、进一步的，所述基于第一测序结果获取有效序列包括：

13、获取所述第一测序结果中正义链及反义链相同位点的碱基为互补配对的第二测序结果；

14、所述第二测序结果为所述有效序列；

15、所述第二测序结果的数量为所述有效数据量。

16、进一步的，所述基于有效序列和序列样本，获取所述有效数据量中的有效总错误量和测序错误量包括：

17、基于所述预设值、所述有效数据量，计算所述测序错误量；

18、统计所述有效序列和所述序列样本相同位点碱基不一致的数量为所述有效总错误量。

19、进一步的，所述基于测序总量、有效数据量、有效总错误量及测序错误量，获取dna聚合酶的扩增保真度包括：

20、基于所述有效总错误量和所述测序错误量获取有效扩增错误量；

21、基于所述有效扩增错误量在有效数据量中的占比，获取测序总量中的总扩增错误量；

22、基于总扩增错误量和序列样本的扩增参数，获取dna聚合酶的扩增保真度。

23、进一步的，所述预设值为30至40中的任意值。

24、进一步的，所述序列样本为已知序列，所述序列样本的长度为50bp至100bp中的任意值。

25、一种dna聚合酶的扩增保真度检测的试剂盒，包括：

26、缓冲液、待检测dna聚合酶混合液、引物及如上述的序列样本；

27、所述引物包括扩增引物及测序引物；

28、其中，所述序列样本在所述待检测dna聚合酶混合液作用下能够扩增。

29、进一步的，所述序列样本的两侧设置有接头区，所述扩增引物及所述测序引物与所述接头区碱基互补，以扩增所述序列样本或测序所述序列样本。

30、本发明的有益效果在于：

31、本申请分别将扩增后得到测序结果进行数据筛选以获取有效序列、对有效数据量中的测序错误量进行删除，删除测序可信度低的测序值及存在与有效数据中的测序错误值，避免测序结果不稳定的值归入扩增错误内，增加dna聚合酶扩增的保真度数据的准确性。

技术特征：

1.一种dna聚合酶的扩增保真度的检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述扩增参数包括：所述序列样本的初始样本量、扩增效率及扩增轮数，获取所述测序结果的测序总量。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基于测序结果及测序总量，获取有效序列及有效数据量包括：

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述基于第一测序结果获取有效序列包括：

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基于有效序列和序列样本，获取所述有效数据量中的有效总错误量和测序错误量包括：

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基于测序总量、有效数据量、有效总错误量及测序错误量，获取dna聚合酶的扩增保真度包括：

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述预设值为30至40中的任意值。

8.根据权利要求1至6中任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述序列样本为已知序列，所述序列样本的长度为50bp至100bp中的任意值。

9.一种dna聚合酶的扩增保真度检测的试剂盒，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述序列样本的两侧设置有接头区，所述扩增引物及所述测序引物与所述接头区碱基互补，以扩增所述序列样本或测序所述序列样本。

技术总结
本发明公开了一种DNA聚合酶的扩增保真度的检测方法及试剂盒。该检测方法包括基于扩增参数扩增序列样本，并获取扩增后的测序结果及测序总量；基于预设值、测序结果及测序总量，获取有效序列及有效数据量；基于有效序列和序列样本，获取有效数据量中的有效总错误量和测序错误量；基于测序总量、有效数据量、有效总错误量及测序错误量，获取DNA聚合酶的扩增保真度。将扩增后得到测序结果进行数据筛选以获取有效序列、对有效数据量中的测序错误量进行删除，删除测序可信度低的测序值及存在与有效数据中的测序错误值，避免测序结果不稳定的值归入扩增错误内，增加DNA聚合酶扩增的保真度数据的准确性。

技术研发人员：程云阳,操利超,巴颖,卢晓萍,沈嘉怡,黄翠翠,余多海,陈莹莹,余晨笛,吴敏
受保护的技术使用者：深圳核子华曦医学检验实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15