MRSA脓毒症相关DIC的生物标记物及其作用机制的研究方法

本发明涉及mrsa脓毒症相关dic的生物标记物及其作用机制的研究方法，属于生物标记物。

背景技术：

1、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，dic)是脓毒症最常见的并发症，具有较高的发病率和死亡率。据统计，脓毒症患者诱发dic的发病率约20％-50％，而在发生dic 30天内患者死亡率高达45％，已成为导致脓毒症患者死亡和预后不良的关键因素。细菌感染是诱发脓毒症的首位病因，随抗生素在脓毒症治疗中的广泛使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa)已成为院内和社区感染的主要致病菌。mrsa的多重耐药甚至泛耐药，导致mrsa脓毒症相关dic病程延长，临床治疗愈加困难。

2、dic是多因素导致的微血管损伤，从而活化凝血系统形成广泛的微血栓，凝血因子消耗并继发纤溶亢进，引起的以出血和微循环衰竭为特征的一种临床综合征，最常见于脓毒症等感染性疾病。在脓毒症早期，机体通过凝血级联反应阻止病菌扩散、阻碍氧气和营养物质的输送，抵抗病原菌入侵。然而，随疾病发展，巨噬细胞失控的炎症反应可以提高tf活性并诱导其表达和释放，激活凝血系统，使机体持续处于高凝状态，对组织脏器造成不可逆的损伤。据统计，全球每年约有3000万人罹患脓毒症，我国每年新增脓毒症患者约250万；脓毒症患者凝血功能异常的发病率为50％-70％，轻者仅表现为凝血因子活性改变或血小板计数异常，而随疾病进展，约35％的危重患者出现dic，导致微血栓形成，出现全身出血和多器官功能障碍等症状，是脓毒症患者死亡的主要原因。

3、基于国内外脓毒症及相关dic的多个诊疗指南及研究报道，2017年我国急诊专家针对该疾病的诊疗共识起草了《脓毒症并发弥散性血管内凝血诊治急诊专家共识》，关于脓毒症相关dic提出了四方面治疗建议：病因(抗感染)治疗、抗凝治疗、替代治疗和中药治疗。抗菌药物是治疗首要措施，然而抗生素的开发和应用在有效降低患者死亡率的同时，多重耐药性细菌也随之产生。2021年全国细菌耐药检测网报道，我国mrsa平均检出率为29.4％，各地区mrsa检出率为15.2％-46.0％。值得注意的是，近年来革兰氏阳性菌脓毒症发病率逐年升高，占脓毒症40％以上，而mrsa已成为主要的革兰氏阳性耐药菌mrsa脓毒症相关dic不仅病情严重，病程延长，且患者预后不良，死亡率升高。尽管针对mrsa脓毒症相关dic的早期诊疗流程不断规范，抗感染、脏器支持等治疗方法不断进步，但其发病率和死亡率仍居高不下，且抗凝治疗显著增加了患者的出血风险，替代治疗需根据患者血液成分进行。因此，探寻新的、有效的mrsa脓毒症相关dic的生物标记物，及靶向治疗该疾病的新策略刻不容缓。

4、巨噬细胞是人体最主要的免疫细胞，在感染性疾病中承担着启动炎症反应，清除体内病原菌的作用。近年来，研究人员揭示了巨噬细胞焦亡可诱发脓毒症相关dic的新发病机制，然而基于该发病机制的靶向调控蛋白却知之甚少。

5、yod1是卵巢癌家族中高保守的去泛素化酶，由348个氨基酸组成，主要通过移除蛋白的泛素化修饰，调控蛋白活性和功能。目前的相关研究表明，yod1与多种疾病的发生、发展密切相关。在卵巢癌中发现，yod1在卵巢癌组织中表达升高，增强了卵巢癌细胞的迁移能力；在恶性骨肉瘤的研究中发现，抑制yod1的表达可以降低骨肉瘤细胞的活力、增殖和黏附能力；在肝癌中证实，yod1可以通过增强yap/taz的活性来促进肝细胞的增殖；在肾脏疾病中的研究发现，yod1能够特异性移除nedd4的k63位泛素化修饰，从而抑制细胞增殖；还有一些发现，yod1依赖其去泛素化酶活性，有效的降解大脑中的异常蛋白，延缓帕金森等神经退行性疾病的发展。

6、研究发现yod1可抑制mrsa脓毒症相关dic的进展，上述内容迄今为止未见任何报道。由此，以yod1为切入点，阐释其在mrsa脓毒症相关dic中的调控作用及分子机制，有望为该疾病的靶向治疗及生物标记物的研发提供新的思路。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供mrsa脓毒症相关dic的生物标记物。

2、本发明的第一目的在于提供上述生物标记物的作用机制的研究方法

3、为了实现第一目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：mrsa脓毒症相关dic的生物标记物，所述生物标记物为去泛素化酶yod1。

4、为了实现第二目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：mrsa脓毒症相关dic的生物标记物作用机制的研究方法，包括如下步骤：

5、s1：脓毒症小鼠模型的构建；

6、s2：血液及组织取材；

7、s3：血液、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中mrsa菌落数量计数；

8、s4：分析各组小鼠生存曲线；

9、s5：计算各组小鼠血小板数量；

10、s6：elisa检测各组小鼠血清中d-dimer，fib，tat，pai-1的水平；

11、s7：采用苏木素-伊红(h&e)进行组织染色

12、s8：小鼠腹腔及骨髓来源巨噬细胞的分离及培养；

13、s9：western blot检测小鼠巨噬细胞中yod1蛋白的表达；

14、s10：qpcr检测小鼠巨噬细胞中yod1 mrna的表达；

15、s11：统计学分析。

16、优选的，步骤s1具体为：选取6-8周龄wt小鼠和yod1-/-小鼠，随机分为4组：wt pbs组、wt mrsa感染组、yod1-/-pbs组、yod1-/-mrsa感染组，感染组小鼠经尾静脉注射菌悬液，pbs组注射等量的pbs；感染12h后，收集小鼠血液和组织。

17、优选的，步骤s2具体为：

18、s2.1：血液采集

19、用无菌注射器对其心脏穿刺抽取血液。

20、s2.2：组织取材

21、根据器官位置摘取完整组织，在无菌pbs中清洗，用无菌纱布吸去表面液体，保持组织原有状态装入ep管中。

22、优选的，步骤s3具体为：取等质量的组织放入无菌ep管中，加入pbs，研磨至匀浆；将血液和组织匀浆用pbs进行稀释，置于胰蛋白胨大豆琼脂培养基上，37℃恒温培养箱培养24h，根据培养基的菌落数量确定对应组织的细菌负荷量。

23、优选的，步骤s4具体为：将mrsa用无菌pbs稀释至浓度为1×109cfu/ml，感染组小鼠经尾静脉注射100μl菌悬液，pbs组注射等量的pbs，观察各组小鼠14天生存率。

24、优选的，步骤s5具体为：收集的各组小鼠心脏血液采用edta-k2抗凝，使用maccuradh-510自动血液分析仪检测血小板数量。

25、优选的，步骤s6具体为：在酶标包被板上分别设空白孔、待测样品孔、标准品孔；依次加入样品、生物素标记的抗抗体、酶标试剂，37℃孵育后冲洗，拍干；每孔加入显色剂，37℃室温避光显色15min，加入终止液以终止反应，以空白孔调零，在450nm波长处测量各孔吸光度，并根据标准品绘制的标准曲线计算样品浓度。

26、优选的，步骤s8具体为：选取6-8周龄的c57bl/6j小鼠，腹腔注射4％巯基乙酸盐溶液，三天半后，将小鼠处死，收集腹腔渗出细胞；离心弃去上清液，用含有10％fbs的rpmi1640培养基重悬细胞至适宜浓度，并将其接种到细胞培养板，培养2.5h后，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞；6-8周龄的c57bl/6j小鼠颈椎脱臼处死，取下完整的股骨和胫骨，pbs溶液中清洗，分离股骨和胫骨，暴露骨腔，用注射器吸取培养基(dmem高糖+10％fbs)反复冲洗骨腔内细胞，收集的细胞液轻柔吹打混匀，经70μm细胞筛过滤。裂解红细胞后，用培养基rpmi 1640+15％ fbs+1％p/s+10ng/ml m-csf重悬，接种在培养皿中并放置于培养箱培养。3天后，补加等量的培养基(含m-csf浓度为20ng/ml)继续培养。培养的第7天，底部贴壁细胞即为诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞。

27、优选的，步骤s9具体为：

28、s9.1：将步骤s8得到的巨噬细胞进行接种，分为mrsa未感染组和mrsa感染组，加入细胞裂解液冰上裂解，离心取上清液，bca法测定蛋白浓度；

29、s9.2：经sds-page凝胶电泳分离后，将蛋白转移到pvdf膜上，过夜孵育，用tbst缓冲液冲洗，再用带有hrp标记的羊抗兔或羊抗鼠igg孵育，用tbst缓冲液冲洗；

30、s9.3：使用化学发光成像系统采集图像，image j软件进行分析统计，其中以β-actin为内参，以目的蛋白条带与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平。

31、优选的，步骤s10具体为：使用trizol试剂提取细胞总rna，逆转录为cdna，利用sybr green染料法real-time pcr进行半定量基因表达量检测。

32、本发明的有益效果：

33、(1)本技术证实yod1抑制mrsa脓毒症相关dic的发生、发展，对于理解mrsa脓毒症相关dic具有重要意义；且yod1在mrsa感染后表达增高，进而可阻碍mrsa脓毒症相关dic的进展，有望成为脓毒症相关dic的生物标记物或临床治疗靶点。

34、(2)在小鼠巨噬细胞中加入mrsa感染，yod1表达显著增高；且与野生型小鼠相比，yod1-/-小鼠感染mrsa后，可在其主要组织脏器中检测到更多的mrsa，且血清中凝血相关指标增高，小鼠14天生存率下降，提示yod1可能是mrsa脓毒症相关dic的生物学标志物。