具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用。
背景技术：
：：1、外泌体是具有源自内膜系统的膜结构的纳米级细胞外囊泡，直径为 40~100 nm的颗粒，包含来自供体细胞的物质，例如蛋白质、脂质和核酸，并通过将这些物质转移到受体细胞从而实现细胞与细胞间的信息交流（yi, q., z. xu, a. thakur, k. zhang, q.liang, y. liu and y. yan (2023). "current understanding of plant-derivedexosome-like nanoparticles in regulating the inflammatory response and immunesystem microenvironment." pharmacological research 190: 106733.）。外泌体介导细胞通讯，并参与正常和病理生物学途径，其通过递送生长因子、蛋白质、microrna、信使rna、非编码 rna 和脂质来诱导组织再生（chavda, v. p., a. pandya, l. kumar, n.raval, l. k. vora, s. pulakkat, v. patravale, y. duo and b. z. tang (2023). "exosome nanovesicles: a potential carrier for therapeutic delivery." nanotoday 49: 101771.）。外泌体在医学上具有重要的应用价值，外泌体可以主动或被动地装载或封装治疗药物，同时外泌体主要通过三种方式被靶细胞吸收：胞吞作用、配体-受体结合或直接结合，为临床诊断和治疗干预提供了新的潜在目标（de sousa, k. p., i.rossi, m. abdullahi, m. i. ramirez, d. stratton and j. m. inal (2023). "isolation and characterization of extracellular vesicles and futuredirections in diagnosis and therapy." wiley interdisciplinary reviews:nanomedicine and nanobiotechnology 15(1): e1835.）。2、外泌体按来源可以分为动物外泌体和植物外泌体，两者均可用作高度特异性的药物递送系统。近年来，利用外泌体靶向运输和释放药物进行疾病的治疗已经取得了临床前的成功。例如，发现外泌体封装可以提高姜黄素的溶解度、稳定性和抗炎特性（sun, d., x.zhuang, x. xiang, y. liu, s. zhang, c. liu, s. barnes, w. grizzle, d. millerand h.-g. zhang (2010). "a novel nanoparticle drug delivery system: the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes."molecular therapy 18(9): 1606~1614.）。外泌体具有较长的循环半衰期，被人体很好地耐受，不仅能够穿透细胞膜，还可能靶向特定的细胞类型，这使得它们成为免疫学应用的最佳候选者。此外，蛋白质和遗传物质加载到外泌体中的能力是使外泌体成为有吸引力的药物递送系统的另一个优势（doyle, l. m. and m. z. wang (2019). "overview ofextracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods forexosome isolation and analysis." cells 8(7): 727.）。因此，外泌体近年来成为药物输送系统开发的理想选择。3、天然虾青素具有抗氧化、抗衰老、抗炎和抗动脉粥样硬化等多种特性，因此它已成为供人类食用的各种医药产品中的活性成分（eren, b., s. tuncay tanrıverdi, f. aydın köse and ö. özer (2019). "antioxidant properties evaluation of topicalastaxanthin formulations as anti‐aging products." journal of cosmeticdermatology 18(1): 242~250.）。人工生产的虾青素目前在天然虾青素市场上占主导地位，但人类食用后已经观察到副作用，因此天然虾青素变得不可或缺（capelli, b., d.bagchi and g. r. cysewski (2013). "synthetic astaxanthin is significantlyinferior to algal-based astaxanthin as an antioxidant and may not be suitableas a human nutraceutical supplement." nutrafoods 12: 145~152.）。天然虾青素是非结晶的，主要以酯类形式存在，可溶于脂质。与其他天然抗氧化剂如番茄红素、玉米黄质、叶黄素、α/β-胡萝卜素、α-生育酚、trolox等相比，虾青素的抗氧化性能更强（yeh, p.-t.,h.-w. huang, c.-m. yang, w.-s. yang and c.-h. yang (2016). "astaxanthininhibits expression of retinal oxidative stress and inflammatory mediators instreptozotocin-induced diabetic rats." plos one 11(1): e0146438.）。由此可见虾青素的抗氧化特性在保健品、医药、化妆品等方面具有广阔的应用前景。4、天然虾青素的生物来源一般有三种：水产品加工工业的废弃物，酵母提取，和藻类提取。现在世界公认的天然虾青素的最佳来源是藻类。微藻生长速度快，营养丰富，在水产养殖、保健等诸多领域具有广泛的用途，微藻是快速获得虾青素的生物来源，因此，进行工程化改造微藻，进一步提高微藻的应用潜力和虾青素的含量具有重要的研究和实用价值。技术实现思路1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用。2、本发明提供了mir394在调控微藻的脂质合成、脂质分泌和虾青素含量中的应用。所述mir394来源于微藻，所述微藻包括但不限于螺旋藻、小球藻、红球藻、微拟球藻或盐藻等。3、进一步的，4、所述微藻包括微拟球藻，本发明的具体实施例中，所述微藻为微拟球藻（ nannochloropsis oceanica，national center for marine algae and microbiota，usa，编号ccap 849/10）； 5、所述mir394来源于微拟球藻，具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。6、本发明提供了基因工程微藻，其mir394的表达升高或降低；7、所述mir394具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。8、进一步的，本发明所述的基因工程微藻，其起始藻株包括微拟球藻。9、更进一步的，所述起始藻株为微拟球藻，具体为来源于national center formarine algae and microbiota，usa，编号ccap 849/10的微拟球藻 nannochloropsis  oceanica。 10、本发明提供了所述基因工程微藻的制备方法，所述制备方法包括以含有mir394的重组载体，转化或转染微藻；或基因组整合含有mir394的表达单元。11、进一步的，本发明的一些实施例中，所述重组载体的元件还包括：博来霉素抗性基因、phsp20启动子、tmv为增强子和/或ccmp1779/4210-terminator终止子中的一种或多种。12、本发明的一些具体实施例中，所述重组载体的元件具体包括：phsp20热休克蛋白20启动子；tmv增强子；mir394基因（seq id no:1）；eyfp增强型黄色荧光蛋白；flag蛋白标记标签；ccmp1779/4210-terminator终止子；pldspldsp启动子；sh ble博来霉素抗性基因；hsp20-t-8259热休克蛋白20终止子；ampr氨苄青霉素基因；ori复制起点。13、本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对微藻中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知微藻利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中，编码本发明提供的融合蛋白的核酸可构建于各种真核表达载体中。14、本发明所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。15、本发明实验证明mir394可调控微拟球藻的脂质的合成和分泌和所述分泌脂质中的虾青素含量，经证明，所述脂质分泌为脂滴，所述脂滴组成成分与外泌体相似，因此命名为类外泌体。本发明的一些具体的实施例中，通过将携带mir394的重组载体导入微拟球藻，构建了mir394过表达的微拟球藻工程菌株，所述菌株脂质合成和分泌以及虾青素含量升高。尽管虾青素为脂溶性素色素，提高脂质含量可提高虾青素的溶解量，但实际试验过程中，并不是所有的提高脂质合成和分泌的工程微藻的虾青素含量均会提高，如专利cn115992052a中脂质合成和分泌提高，但其改造微藻中基本不含有虾青素，微藻细胞为白色。本发明第一次揭示了mir394具有提高微藻脂质合成和分泌以及虾青素含量的功能。16、本发明中，所述虾青素存在于所述类外泌体中，为脂化虾青素，与普通合成的游离的虾青素相比较，温度耐受性和盐度耐受性（0~40度，海水），在常温可以稳定保存；且酯化虾青素，免疫原性低，抗氧化能力强，应用范围广，如化妆品、眼科用药、癌症用药等领域。17、本发明提供了所述的基因工程微藻分泌的类外泌体。18、本发明提供了所述的类外泌体的制备方法，其包括培养如本发明所述的基因工程微藻，获得含有所述的类外泌体的混合物。19、进一步的，本发明所述的制备方法，其还包括所述混合物的分离纯化，所述分离纯化的方法为超高速冷冻离心。20、本发明提供了如下i）~iv）所示中的至少一项在制备含有虾青素的产品和/或抗氧化产品中的应用：21、i）、本发明所述的基因工程微藻；22、ii）、本发明所述的基因工程微藻的制备方法制得的基因工程微藻；23、iii）、本发明所述的类外泌体；24、iv）、本发明所述的制备方法制得的含有所述类外泌体的混合物。25、进一步的，所述抗氧化产品中含有虾青素，所述抗氧化功能可通过利用本发明含有虾青素的类外泌体获得。26、本发明提供了抗氧化的方法，其为利用本发明所述的类外泌体。27、本发明提供了组合物，其包括本发明所述的类外泌体和其他功能物质，所述功能物质包括脂溶性药物，所述药物包括但不限于核酸药物和/或化学药物。28、本发明提供了所述的类外泌体和/或所述的制备方法制得的含有所述类外泌体的混合物作为运载载体在制备药物和化妆品中的应用。29、本发明通过将携带mir394的重组载体导入微拟球藻，构建了微拟球藻工程菌株，试验结果表明，所述微拟球藻工程菌株具有较高的脂质合成和分泌，且虾青素含量也显著提高，所述菌株作为运载载体或虾青素的生产菌株，和其分泌的脂滴（类外泌体）作为运载载体，可广泛应用于食品、化妆品、药品等领域。当前第1页12当前第1页12