一种用于检测鸭源性成分的LAMP-Taqman引物和探针组合、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及肉及肉制品安全检测，尤其涉及一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合、试剂盒及应用。

背景技术：

1、近年来，随着生活水平的不断改善，肉类消费需求呈逐年增长的趋势。同时，食品加工工艺也在不断提高，肉类食材经过加工后很大程度改变了食材原有的色泽、味道、纹理、气味等特性，导致传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。肉类及肉制品掺假已成为食品质量控制面临的主要挑战之一。肉类掺杂使假主要分为全部替代和部分替换，例如，一些夜市使用鸭肉串作为羊肉串进行售卖、在羊肉卷、羊肉馅中掺加鸭肉、某些牛肉速冻水饺中原料首位也多为鸭肉、猪肉和鸡肉一种或多种混合，牛肉实际用量无法确定。肉类或肉制品掺杂使假还极可能引入过敏原，危害消费者健康。

2、目前，肉类认证检测技术以定性检测为主，主要包括光谱法、质谱法、色谱法、elisa法、pra法、聚合酶链式反应(pcr)法、激光诱导击穿光谱(libs)方法、环介导等温扩增(lamp)法等。光谱法、质谱法、色谱法、pra法和pcr法，所用试剂价格较高、检测仪器昂贵，检测成本高，且对操作人员的专业素质要求较高，限制了肉类检测的广泛推广。elisa法操作步骤繁琐，检测时间长，且样品加工处理可能导致蛋白质变性，在高度加工肉制品中的应用受到限制。lamp由于其快速简便、仪器廉价等优势迅速发展起来。然而lamp法通过凝胶成像结果只能定性，无法进行定量检测，同时具有特异性不高，易产生非特性扩增，造成“假阳性”等缺点。因此，开发快捷、简便、实用的定量检测技术对保护消费者利益，以及保证消费者身体健康、保证市场公平竞争至关重要。

技术实现思路

1、针对现有lamp方法鸭源性成分检测方法存在的假阳性概率高、无法定量检测、以及检测方法繁琐、检测成本高等问题，本发明提供一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合、试剂盒及应用。利用本发明提供的检测鸭源性成分的引物和探针组合，可在60℃-63℃恒温条件下快速检测鸭源性成分，且特异性好、灵敏度高，同时又具备定性定量、避免非特异性扩增、降低气溶胶污染等优势，有利于促进鸭源性成分快速定性定量检测技术的实际市场应用推广。

2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合，包括：

4、内引物fip：5′-ttacggtagctcctcagaacgattatagcaactgcct tcgtag-3′(seq idno:1)；

5、内引物bip：5′-accctggtagaatgagcctgatgaatggcgaagaat cgg-3′(seq id no:2)；

6、外引物f3：5′-gagtaatcctactgctcactc-3′(seq id no:3)；

7、外引物b3：5′-gcctgattcgtgtaggaag-3′(seq id no:4)；

8、环引物lf：5′-tcctcatggcaggacataac-3′(seq id no:5)；

9、环引物探针lbp：5′-ggaggattctcagtggataacc-3′(seq id no:6)。

10、相对于现有技术，本发明提供的lamp-taqman检测鸭源性成分的引物和探针，可以特异性结合到鸭源的核酸上，准确检测出鸭源性成分，且通过将下游环引物lb设计为环引物探针lbp，不但减少了非特异性扩增，降低了假阳性的概率，还有效提高了鸭源性成分的检测效率。本发明提供的引物和探针组合，与牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、马肉、虾肉等14种动物源成分均无交叉扩增反应，特异性显著；且上述引物和探针组合的灵敏度高，对鸭源性成分的最低检出质量浓度为0.001％，同时，检测的准确度高，用时短，在60℃恒温条件下快速扩增，仅需26min就可以达到检测水平，检测时间明显缩短，除此之外，还无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在非实验室条件下快速检测鸭源性成分的目的，对于促进鸭源性成分快速定性定量检测技术在实际市场应用的推广具有十分重要的意义。

11、优选的，所述环引物探针lbp的5′端标记有荧光基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

12、进一步地，所述荧光基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq。

13、进一步地，所述环引物探针lbp为：5′-fam-ggaggattctcagtgga taacc-3′bhq。

14、第二方面，本发明还提供了上述用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合在非诊断性检测鸭源性成分中的应用。

15、第三方面，本发明还提供了一种用于检测鸭源性成分的试剂盒，包含上述任一项所述的用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合。

16、进一步地，所述用于检测鸭源性成分的试剂盒还包括缓冲液、dna聚合酶、硫酸镁溶液、dtnps和去离子水。

17、进一步地，所述缓冲液为thermopol buffe。

18、进一步地，所述dna聚合酶包括bst dna polymerase large fragment和taq dnapolymerase。

19、进一步地，所述用于检测鸭源性成分的试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

20、进一步地，所述阴性对照为灭菌水，所述阳性对照为国标方法(gb/t38164-2019)确认过的ct约为20的鸭源性成分的核酸。

21、上述优选的反应条件可进一步提高鸭源性成分的检测效率。

22、本发明还提供了利用上述试剂盒检测鸭源性成分的方法，具体操作为：提取鸭源性成分的核酸为模板，用所述试剂盒进行lamp扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

23、若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为鸭源性成分阳性；若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为鸭源性成分阴性。

24、上述检测鸭源性成分的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，能够快速准确的从众多肉制品中检测出鸭肉，对鸭肉的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。

25、进一步地，所述lamp扩增的体系包括以下试剂及用量：1×thermopol buffer，bstdna polymerase large fragment 8u，taq dna polymerase 5u，mgso4 1.4mm，dntps1.4mm，内引物fip 2.0μm，内引物bip 2.0μm，外引物f3 0.5μm，外引物b3 0.5μm，环引物lf1.5μm，环引物探针lbp 1.5μm，ddh2o补足24μl。

26、需要说明的是，ddh2o根据实验试剂的用量确定是否需要进行添加，若各试剂总体积不足24μl则加入ddh2o补足，若各试剂总体积已满足24μl，则无需加入ddh2o。

27、优选的，所述lamp扩增的反应温度为60℃-63℃，反应时间为26-50min。

28、进一步优选的，所述lamp扩增的反应温度为60℃，反应时间为30min。

29、优选的lamp扩增条件，可以提高鸭源性成分的检测效率。

30、本发明提供的用于鸭源性成分检测的引物和探针组合，具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速鉴别出肉制品中是否含有鸭源性成分，并且能够从含有多种肉制品中特异性扩增出鸭源性成分的dna，有效避免了假阳性检测结果的出现，为准确定量检测鸭源性成分提供了有效手段，对于防止敏感人群食入含鸭肉制品后过敏现象的发生和促进市场公平竞争具有重要意义，为我国动物源性产品的检测、监测提供了便捷、可靠的技术保障，在肉制品检测领域具有较高的实用价值。