用于合成复杂香豆素的CYP450环化酶基因PpDC与PpOC及其应用

本发明属于基因工程，尤其涉及用于合成复杂香豆素的cyp450环化酶基因ppdc与ppoc及其应用。

背景技术：

1、伞形科植物白花前胡的干燥根为化痰止咳平喘的常用中药前胡，前胡具有降气化痰、散风清热的功效，现代药理研究表明其具有钙拮抗剂、降压、抗肿瘤、抗病毒、抗炎及逆转肿瘤多药耐药等多种药理作用。目前，由于人类的大量开采，野生前胡的产量已经难以满足日益增长的市场需求。尽管许多地方已有人工栽培，但是由于人工种植的前胡在第二年就开花，其品质受到严重影响，并且前胡种植对土质和环境的要求较高，人工成本也随之升高，因此，探索其他高效的生产方式刻不容缓。

2、近年来，分子生物学及代谢工程的兴起给人们带来了新的思路与出路。其基本观点是应用代谢工程的方法在生物体或细胞器(比如大肠杆菌，酵母菌)的水平上生产药用有效成分，该技术的发展主要受限于难以找到合成药用有效成分的关键蛋白酶及编码它们的基因。但该法具有耗时少、单位产量大、不受季节、气候等自然条件的影响等优势，因此，利用分子生物学和代谢工程技术生产药物有效成分具有广泛的应用前景。

3、香豆素类化合物是前胡主要的物质基础，是一大类次生代谢物，在结构上，香豆素具有常见的1,2-苯并吡咯酮骨架，一般分为简单香豆素、线型呋喃香豆素、线型吡喃香豆素、角型吡喃香豆素、角型呋喃香豆素等。虽然香豆素的结构骨架不是很复杂，但其生物合成机制仍不明确。环化是呋喃香豆素和吡喃香豆素骨架生物合成的最后一步，也是决定香豆素化学多样性的一个重要酶。然而，到目前为止，只在桑科中克隆到了一个负责线型呋喃香豆素生物合成的基因，在伞形科和芸香科中未见报道。此外，不同类型的香豆素的环化机制以及植物进化产生不同类型的香豆素的机制仍不清楚。因此，获得环化酶基因并进行功能验证，对于了解香豆素的化学多样性机制意义重大，同时也为用合成生物学方法生产复杂香豆素化合物以及用植物基因工程的方法调控白花前胡品质提供理论基础。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了用于合成复杂香豆素的cyp450环化酶基因ppdc与ppoc及其应用。

2、技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种用于合成复杂香豆素的cyp450环化酶基因ppdc，所述ppdc的cds区核苷酸序列如seq id no:1所示。

4、本发明还提供了一种用于合成复杂香豆素的cyp450环化酶基因ppoc，所述ppoc的cds区核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明利用生物信息学技术对白花前胡全长转录组测序结果进行分析，挖掘到了一条注释为7-去甲基软木花椒素环化酶的基因ppdc和一条注释为王草酚环化酶的基因ppoc，分别为其设计一对用于pcr扩增的特异性引物：ppdc-f:5’-cttggtaccgagctcggatccatgtctctagttgattttgtccc-3’

6、ppdc-r:5’-tgatggatatctgcagaattcttagcgaatcttcggtatggcttc-3’；和ppoc-f:5’-cttggtaccgagctcggatccatgtctcccattgctttggc-3’

7、ppoc-r：5’-tgatggatatctgcagaattcttaaatttgacgaatcttcggtatg-3’；

8、对白花前胡根和叶片样品cdna进行pcr扩增，获得了催化白花前胡中7-去甲基软木花椒素环化的功能基因的cds序列(全长为1494bp)、催化王草酚环化的功能基因的cds序列(全长为1515bp)，ppdc基因的cds序列具体如seq id no:1所示的核苷酸序列，ppoc基因的cds序列具体如seq id no:2所示的核苷酸序列。

9、第二方面，本发明提供了所述的cyp450环化酶基因ppdc编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:3所示，或经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

10、本发明还提供了所述的cyp450环化酶基因ppoc编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:4所示，或经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

11、第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，其含有所述的cyp450环化酶基因ppdc，或者含有所述的cyp450环化酶基因ppoc。

12、优选的，所述重组表达载体为pyes2.0。具体的，所述重组表达载体为pyes2-ppdc或pyes2-ppoc。

13、第四方面，本发明提供了一种重组表达工程菌，其含有所述的cyp450环化酶基因ppdc，或者含有所述的cyp450环化酶基因ppoc，或者含有所述的重组表达载体。

14、作为优选，所述重组表达工程菌为酿酒酵母菌；更优选的，所述酿酒酵母菌选自酿酒酵母菌株wat11。

15、作为本发明的优势方案，本发明提供了两种重组表达工程菌，将ppdc基因和ppoc基因构建到表达载体pyes2.0上，用所得重组表达载体转化酿酒酵母wat11，筛选阳性菌株构建酵母工程菌，得到重组表达工程菌。培养工程菌，从培养物中获得环化酶ppdc和ppoc。

16、此外，本发明除了重组表达载体、重组表达工程菌和重组环化酶ppdc和ppoc之外，还可以是包括所述环化酶基因ppdc和ppoc的表达盒、转基因细胞系等。

17、第五方面，本发明提供了所述的cyp450环化酶基因ppdc、所述的cyp450环化酶基因ppoc、所述的蛋白质、所述的重组表达载体、所述的重组表达工程菌在合成复杂香豆素中的应用。具体地，在合成吡喃香豆素和呋喃香豆素中的应用。

18、进一步的，本发明提供了所述的cyp450环化酶基因ppdc、所述的蛋白质、含有所述的cyp450环化酶基因ppdc的重组表达载体、含有所述的cyp450环化酶基因ppdc的重组表达工程菌在催化7-去甲基软木花椒素环化中的应用。具体地，催化7-去甲基软木花椒素进行环化反应合成线型吡喃香豆素和呋喃香豆素。

19、进一步的，本发明提供了所述的cyp450环化酶基因ppoc、所述的蛋白质、含有所述的cyp450环化酶基因ppoc的重组表达载体、含有所述的cyp450环化酶基因ppoc的重组表达工程菌在催化王草酚环化中的应用。具体地，催化王草酚进行环化反应合成角型吡喃香豆素和呋喃香豆素。

20、有益效果：与现有技术相比，本发明针白花前胡中关键基因研究基础薄弱的现状，首次从白花前胡中克隆得到催化7-去甲基软木花椒素环化的ppdc基因和催化王草酚环化的ppoc基因，这两个基因是呋喃香豆素和吡喃香豆素骨架生物合成的关键基因。ppdc基因和ppoc基因所编码的蛋白酶在不同ph条件下的催化产物不同，其催化机理可能是对经典baldwin规则的一些修改或扩增。采用分子生物技术对ppdc基因和ppoc基因进行功能验证，对于了解香豆素的化学多样性机制意义深重，同时能够为将来利用合成生物学方法生产复杂香豆素化合物以及用植物基因工程的方法调控白花前胡品质提供理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。