一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法

本发明涉及病毒影响猪睾丸细胞，具体为一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法。

背景技术：

1、目前未有明确机制说明猪瘟病毒感染导致精液带毒的原因。公猪感染猪瘟病毒后精液带毒、品质下降，并可通过精液感染母猪，是造成猪繁殖障碍问题的重要原因之一。

2、公猪睾丸存在血睾屏障结构，为精子发生提供相对独立、安全的微环境。睾丸支持细胞是构成血睾屏障的重要组成细胞，参与血睾屏障的形成。一旦血睾屏障受损，就会导致有害因子进入精细管腔损害生精细胞。猪瘟病毒能出现在精液中是否破坏了血睾屏障，是否影响组成血睾屏障的重要细胞-支持细胞的屏障和渗透性。

3、于是我们通过对单层支持细胞电阻和渗透性检测，评估猪瘟病毒对细胞屏障功能的影响。同时通过wb方法验证猪瘟病毒对屏障结构紧密相关的细胞间连接蛋白进行验证。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，解决了上述背景技术中提出的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，包括以下材料的准备；

3、猪睾丸支持细胞、csfv病毒液、dmem完全培养基、dmem基础培养基、hbss缓冲液、fitc标记葡聚糖荧光素、兔源抗zo-1蛋白、occludin的蛋白、connexin43蛋白和猪瘟病毒e2蛋白的抗体、transwell小室、12孔细胞培养板、96孔避光板、电阻仪、荧光酶标仪；

4、检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法的具体步骤如下：

5、s1、transwell小室的活化与病毒灭活的准备；

6、(1)实验开始前准备，向每个transwell上室加入0.5ml完全培养基将上室底膜过夜水化；

7、(2)取csfv病毒液室温融化，添加适量病毒液于培养皿中，放入无菌操作台中，暴露紫外照射2h，回收灭活毒液-20℃存放备用；

8、s2、细胞跨膜电阻的检测；

9、(1)将t25培养瓶中生长状态良好的猪睾丸支持细胞加1.5ml胰酶消化3min，弃胰酶加3ml完全培养基吹打细胞直至脱落；

10、(2)将细胞液转移至15ml离心管中离心，1000rpm/4min，弃上清，加入3ml完全培养基重悬混匀，接种250μl至上室使每孔细胞覆盖底膜面积占比50％左右，上室补250μl完全培养基，下室加入1ml完全培养基，24h后细胞完全贴壁；

11、(3)将镊子废液缸等实验必需器材酒精喷洒表面后放入生物安全柜紫外灭菌10min，灭菌结束，将transwell板从二氧化碳培养箱轻轻取出显微镜观察细胞密度及污染情况；

12、(4)开启生物安全柜，将电阻仪双电极用75％酒精棉球消毒风干后，打开电阻仪并调节拨杆至“ω”档位，将双电极竖直放入37℃预热hbss中平衡10min；

13、(5)镊子夹起上室一侧倾倒培养基，向上室加入37℃预热hbss 0.5ml，下室加入1ml hbss，平衡10min后移除hbss，加入等量37℃预热hbss，将双电极较短一侧沿上室壁竖直下移至上室底膜上缘，较长一侧沿上室边缘孔贯穿至下室；

14、依据此方法，每一次测值遵循同位同处理原则，双电极保持在上下室的相同部位测值；每个小室测定三个不同方位的值；移除hbss，添加等量完全培养基，放回培养箱中；

15、s3、细胞接毒后跨膜电阻的检测；

16、(1)细胞培养至完全覆盖底膜时，保持每日电阻检测，待teer值恒定并维持恒定值满3日后，取出transwell板放入生物安全柜，换液；

17、(2)每个12孔transwell板设四个接毒时间处理组，其中接毒处理方式为每孔接种50μl csfv病毒液，待病毒液吸附细胞2h后换dmem基础培养基；

18、(3)接灭活毒处理方式为每孔接种50μl灭活csfv病毒液，2h后换液；

19、(4)空白组细胞除同步换液之外不做任何处理；到达对应时间点后测值，{c样teer值＝(c测定电阻值-空白电阻值)x膜表面积[ω/cm2]}；

20、s4、渗透性检测；

21、(1)取fitc-dextran粉末用hbss缓冲液配制成终浓度为1mg/ml的工作液；

22、(2)对应时间的teer值测量结束后，将上层及下层hbss弃掉，下层换新预热hbss1ml，上层加入0.5ml fitc-dextran工作液，培养箱中静置1h；

23、(3)取全黑避光96孔板，取transwell板，放入无菌操作台中，避光板每个待检孔加入100μl下室样本；

24、s5、westernblot；

25、(1)细胞接毒试验与蛋白样提取；细胞分为试验组与对照组，向六孔板接种猪睾丸支持细胞，细胞贴壁后，按照12、24、36、48h四个时间点接毒并在对应时间点提取蛋白样；

26、(2)蛋白变性与电泳；其中蛋白变性条件为99℃煮10min；

27、(a)使用10％的浓缩胶与分离胶，配制完成灌注、凝固、安装至电泳槽中，加入4℃预冷电泳缓冲液，将电泳槽放入盛有冰水混合物的容器中，开始上样；

28、(b)上样顺序从左到右依次为marker、对照组12h、24h、36h、48h、实验组12h、24h、36h、48h、marker；

29、其中电泳条件是：条带位于浓缩胶时，140v恒压；条带位于浓缩胶分离胶界面处时，调整为120v恒压；指示条带跑至整块胶的3/4处时终止电泳；

30、(3)蛋白转膜；

31、(a)向转膜槽中加入4℃预冷转膜缓冲液，放入冰槽中备用；转膜用夹板上下各覆盖三层滤纸浸泡于转膜缓冲液中备用；

32、(b)根据上述目的蛋白大小对应的marker区间，精准裁切并放置于滤纸上，保持胶的湿润；

33、(c)切割0.4μm孔径的pvdf膜，置于甲醇中浸润15s，取出覆盖于胶上，保持膜的湿润，使用滚轮排掉膜胶之间的气泡，合上转膜夹板插入转膜槽中，补齐缓冲液；

34、其中100kda以下蛋白的转膜条件为200ma恒流2h，100kda以上蛋白的转膜条件为200ma恒流2h+300ma恒流3h；

35、(4)抗体孵育与显影；

36、(a)转膜完成后，膜取出，用自配tbst缓冲液脱色摇床室温中速振荡2min后，弃tbst，每张膜加入5ml无蛋白快速封闭液，置于脱色摇床室温低速振荡1h；

37、(b)弃封闭液，每张膜加入5ml稀释后的一抗，置于脱色摇床4℃低速振荡15h；

38、所用抗体及稀释比例为zo-1、connexin43、occludin，1：1000；内参抗体选用gapdh，1：500；hrp山羊抗兔二抗，1：1000抗体稀释液为无蛋白快速封闭液。

39、可选的，所述方法中包括以下三种涉及技术，分别是transwell细胞培养技术、细胞跨膜电阻检测技术和westernblot。

40、可选的，所述transwell培养板具有上下室结构，上室为可移动结构，底由不同孔径的滤膜组成，下室与传统培养板无差异；而transwell培养模式下的细胞则主要接种于上室；这种细胞培养模式使测量贴壁细胞的膜电阻变得简便，可以反映出细胞单层膜的生长状态。

41、可选的，所述细胞跨膜电阻实验是利用高精度电阻测量仪器对生长中的贴壁细胞进行细胞单层膜电位进行测量从而计算出细胞单层膜电阻的实验。

42、可选的，所述westernblot是根据抗原抗体的特异性反应对特定蛋白进行相对定量的一种试验方法；其基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜，可将胶上蛋白质转移到固相载体表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法可以检测到目的蛋白；westernblot实验用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。

43、可选的，所述dmem完全培养基中含10％胎牛血清。

44、可选的，所述s3中每个12孔transwell板设四个接毒时间处理组，分别为12、24、36、48h无处理、12、24、36、48h接毒、12、24、36、48h灭活病毒。

45、可选的，所述s4中荧光酶标仪的参数为：激发波长485nm、发射波长528nm，正常检测速度、1mm检测高度，测量荧光强度并记录。

46、可选的，所述s5中提取蛋白的方法具体如下：

47、(i)将培养液弃除，加入适量pbs润洗1-3次，每次时间持续10s；

48、(ii)随后将六孔板放置冰上，每孔加入100μl组织细胞裂解工作液，其中包含蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，裂解20s左右将细胞吹下；

49、(iii)转移至预冷的1.5ml离心管中，用4℃离心机离心，参数为12000rpm/10min；

50、(iiii)最后吸取上清转移至新的预冷1.5ml离心管中，定量后分装，-80℃保存。

51、本发明提供了一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，具备以下有益效果：

52、该检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，建立了检测猪瘟病毒对st细胞屏障和渗透功能的检测方法；此方法适用于其它任何可造成动物繁殖障碍病毒对血睾屏障功能的检测；

53、此方法不仅适用于对细胞血睾屏障功能的检测，同样适用于病毒对任何贴壁细胞胞间连接结构和渗透性功能的检测；对于其它病毒感染导致细胞连接结构损伤，细胞通讯改变等致病机制均有参考意义；

54、在此基础上：明确了病毒对细胞屏障功能的影响与病毒量呈正相关(随着病毒增殖，细胞电阻越来越低，细胞紧密连接和缝隙链接蛋白表达量越来越低)，明确了接毒的条件(形成单层膜，电阻稳定第3天)和观测的时间点(接毒后12h、24h、36h、48h)，明确了病毒增殖是影响支持细胞屏障功能的重要因素(灭活病毒对细胞电阻和渗透性没有显著影响)。