DNA-抗原交换和扩增的制作方法

dna-抗原交换和扩增成像方法，能够通过将靶标与抗原、抗原特异性结合配偶体和光学标记连接来多重化靶标并提高靶标的检测灵敏度。

背景技术：

1、产生二级抗体以结合其他抗体，通常具有物种特异性亲和力。在免疫荧光应用中使用二级抗体是很普遍的。二级抗体对于节省成本和信号扩增都是有利的。用荧光团标记二级抗体比直接标记一级抗体更具成本效益，因为可以使用一种类型的荧光标记的二级抗体对许多不同的靶标成像，条件是使用来自相同宿主物种的一级抗体在单独的样品上检测靶标。另外，由于多个荧光标记的二级抗体可以结合单个一级抗体，因此从样品产生的信号强度高于使用荧光标记的一级抗体产生的信号强度。然而，荧光标记的二级抗体的使用严重限制了进行多重化检测的能力。为了多重化多个靶标，必须在不同的宿主物种中产生每个靶标特异性一级抗体，以确保二级抗体与正确的靶标复合物结合并缔合。最常见的一级抗体宿主物种是小鼠和兔子，高质量替代性宿主物种的缺乏降低了多重化能力，这种能力实际上可以用每个样品的两个靶标的二级抗体来实现(即使用标记的抗小鼠二级抗体和标记的抗兔二级抗体来检测用小鼠抗体染色的一个靶标和用兔抗体染色的一个靶标)。

2、先前的方法试图克服用二级抗体进行物种特异性检测所带来的限制。已经描述了包含与抗原或半抗原连接的一级抗体的免疫试剂(wo2016127149)，用于用标记的抗抗原或抗半抗原抗体(即检测抗体)进行检测。虽然这种方法扩大了可以同时标记的靶标的数量，但是可以多重化的靶标的总数仍然受到可用于修饰检测抗体的光谱不同标记的数量的限制。此外，一旦样品被染色，来自检测抗体的信号是固定的并且不能被去除，除非应用严格的条件，而严格的条件可能损害样品。为了实现更高水平的多重化，需要一种温和的足以维持样品完整性的顺序多重化方法。

3、在这里，我们提出了用于高度多重化靶标检测的新方法，所述新方法实现了与标记的二级抗体相关联的相似水平的方便性和改进的扩增。这种方法称为dna-抗原交换和扩增。dna-抗原交换和扩增允许在单个样品上实现靶标的顺序多重化和扩增水平的动态调整。

技术实现思路

1、根据说明书，至少一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与(直接或间接地)连接至光学标记的抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，且其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体；(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(7)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集(诸如(1)-(6)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。

2、在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；(5)添加成像链；其中所述成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且其中每个成像链(直接或间接地)连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的成像链连接至不同的光学标记；(6)任选地去除未结合的成像链；(7)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(8)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(9)任选地重复步骤(1)-(9)，或其任何子集(诸如(1)-(8)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。

3、在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至第一对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且其中每个抗原特异性结合配偶体连接至至少一个第二对接链；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体；(5)通过dna扩增反应增加第二对接链链的数量，并使用光学标记标记所述第二对接链；(6)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(7)任选地熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。

4、在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；(5)通过dna扩增反应增加对接链的数量，并使用光学标记标记所述对接链；(6)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(7)任选地熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。

5、在一些实施方案中，一种组合物包含：(1)第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含对接结构域的寡核苷酸连接的结合配偶体；(2)抗原结合的寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含成像结构域的寡核苷酸连接的抗原，其中(2)的成像结构域与(1)的对接结构域互补；以及(3)标记的抗原特异性结合配偶体，所述标记的抗原特异性结合配偶体包含与抗原特异性结合配偶体连接的光学标记，其中(3)的抗原特异性结合配偶体特异性地结合(2)中的抗原。

6、另外的目的和优点将部分地在下面的说明书中阐述，并且部分地根据说明书将显而易见，或者可以通过实践来学习。借助于所附权利要求中特别指出的元件和组合，将实现和获得这些目的和优点。

7、应当理解，前述一般性描述和以下具体描述都只是示例性和说明性的，并不是对权利要求的限制。

8、包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图示出了一个(几个)实施方案，并与说明书一起用于解释本文所述的原理。