一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用与流程

本发明属于医学视网膜类器官，尤其涉及一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用。

背景技术：

1、类器官突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成更加紧密的细胞间、细胞与基质间高度相互作用，从而发育成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态。2022年9月，美国参议院通过美国食品药品监督管理局现代化法案(fdamodernization act 2.0)，不再要求药物进行动物试验，类器官在基础研究以及临床诊疗方面迎来了更广阔的应用前景。

2、视网膜类器官模型的建立为视网膜疾病机制的研究和干细胞替代疗法提供了强有力的工具。目前，人视网膜类器官研究不断取得突破。人诱导多能干细胞可在一定条件下分化成为具有人类视网膜特征的视网膜类器官，不仅包含多种视网膜细胞，而且能形成与体内形态非常接近的明显分层。然而，实验步骤多、周期长、耗费高、难以标准、规模化生产等不足，限制了人视网膜类器官的应用。

3、因此，发明人致力于设计一种类器官及其构建方法和应用以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：提供一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，耗时短、成本低，可标准化、规模化生产小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系。

2、本发明的另一目的在于：提供一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，为构建视网膜色素变性(retinitispigmentosa,rp)疾病模型提供了新的工具。

3、本发明的又一目的在于：提供一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系在临床诊疗所需药物中的应用。

4、为了达到上述目的，本发明所采用的一种技术方案为：

5、一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，包括以下步骤：

6、步骤1、扩增小鼠胚胎干细胞：将mesc细胞依次在mef饲养层培养体系、无mef饲养层培养体系条件下短期连续传代，制备mesc单细胞悬液；

7、步骤2、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化：将mesc单细胞悬液以5000个/孔的密度接种到u型底细胞培养板进行三维体外培养，胚胎干细胞不断扩增、细胞团簇进一步堆叠向视网膜原基分化，直至出现视泡结构；

8、步骤3、诱导视泡结构发育并出现视杯结构：将培养基更换为视泡培养基，促使视泡结构进一步发育，直至出现视杯结构；

9、步骤4a-1、进一步诱导视杯结构发育：将培养基更换为视杯培养基，促使视杯结构进一步发育；

10、步骤4a-2、获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系：将培养基更换为视网膜类器官培养基，获得成熟的视网膜类器官及其终末分化的细胞系；

11、步骤4b、视网膜祖细胞建库与储存：将步骤3获得的视泡结构进行组织消化，获得视网膜祖细胞悬液，添加视网膜祖细胞培养基传代培养3次，获得视网膜祖细胞系并使用视网膜祖细胞冻存液储存。

12、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述mef饲养层培养体系的构建方法为：将mef细胞在mef培养基培养条件下接种到细胞培养板培养至80％密度，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，加入含10-20μg/ml丝裂霉素-c的mef培养基作用2小时，利用磷酸缓冲盐溶液冲洗丝裂霉素-c，加入胚胎干细胞培养基，构建成mef饲养层培养体系。

13、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述无mef饲养层培养体系的构建方法为：细胞培养板在细胞接种前，预先用0.2％的明胶(gelatine)处理2小时。

14、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述终末分化的细胞系包括视细胞、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞和muller细胞。

15、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述视细胞由crx特异性标记，所述双极细胞由otx2特异标记的、所述节细胞由ebf3特异标记、所述水平细胞和无长突细胞均由calbindin特异标记、所述muller细胞由gfap特异标记。

16、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述mesc细胞悬液接种到mef饲养层培养体系后，需不断更换胚胎干细胞培养基进行培养，直至mesc细胞克隆的密度长到80％，传代形成mesc细胞悬液。

17、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述mesc细胞悬液转移到无mef饲养层培养体系中培养后，需不断更换胚胎干细胞培养基，直至mesc细胞克隆的密度长到80％，制备mesc单细胞悬液。

18、作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述步骤4b中，所述视网膜祖细胞由rax特异性标记。

19、为了达到上述另一目的，本发明所采用的一种技术方案为：

20、一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系由上述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法构建而成。

21、为了达到上述又一目的，本发明所采用的一种技术方案为：

22、一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系作为制备治疗视网膜相关疾病药物的应用。

23、与现有技术相比，本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，依次通过小鼠胚胎干细胞经体外诱导扩增、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化、诱导视泡结构发育并出现视杯结构、进一步诱导视杯结构发育，从而获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，并将视网膜祖细胞建库与储存，整个构建方法可形成标准化流程和质量控制体系，在产业化方面具备很强的自主研发的能力，与人视网膜类器官相比，耗时短、成本低，可标准化、规模化生产，实验成本大大压缩了90％以上。

24、与现有技术相比，本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，由小鼠胚胎干细胞经体外诱导并培养而成，与人视网膜类器官相比，小鼠视网膜类器官同样具备与体内视网膜相似的细胞和形态特征，为构建视网膜色素变性(retinitispigmentosa,rp)疾病模型提供了新的工具。

25、与现有技术相比，本发明所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，可将小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系用于视网膜相关疾病治疗等药物的应用中。

技术特征：

1.一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述mef饲养层培养体系的构建方法为：将mef细胞接种到细胞培养板，更换mef培养基，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，加入含10-20μg/ml丝裂霉素-c的mef培养基作用2小时后，利用磷酸缓冲盐溶液冲洗丝裂霉素-c，加入胚胎干细胞培养基，构建成mef饲养层培养体系。

3.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述无mef饲养层培养体系的构建方法为：细胞培养板在细胞接种前，预先用0.2％的明胶(gelatine)处理2小时。

4.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述终末分化的细胞系包括视细胞、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞和muller细胞。

5.根据权利要求4所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述视细胞由crx特异性标记，所述双极细胞由otx2特异标记的、所述节细胞由ebf3特异标记、所述水平细胞和无长突细胞均由calbindin特异标记、所述muller细胞由gfap特异标记。

6.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，所述mesc细胞悬液接种到mef饲养层培养体系后，需不断更换胚胎干细胞培养基进行培养，直至mesc细胞克隆的密度长到80％，传代形成mesc细胞悬液。

7.根据权利要求6所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述mesc细胞悬液转移到无mef饲养层培养体系中培养后，需不断更换胚胎干细胞培养基，直至mesc细胞克隆的密度长到80％，制备mesc单细胞悬液。

8.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤4b中，所述视网膜祖细胞由rax特异性标记。

9.一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，其特征在于，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系由权利要求1-8任一项所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法构建而成。

10.一种如权利要求9所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，其特征在于，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系作为制备治疗视网膜相关疾病药物的应用。

技术总结
本发明属于医学视网膜类器官技术领域，具体公开了一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法依次通过小鼠胚胎干细胞经体外诱导扩增、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化、诱导视泡结构发育并出现视杯结构、进一步诱导视杯结构发育，从而获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，并将视网膜祖细胞建库与储存，整个构建方法可形成标准化流程和质量控制体系，在产业化方面具备很强的自主研发的能力，与人视网膜类器官相比，耗时短、成本低，可标准化、规模化生产，实验成本大大压缩了90％以上。

技术研发人员：龚明喜
受保护的技术使用者：广州湾区生物基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15