一种姜黄外泌体及其制备方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一种姜黄外泌体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、植物外泌体通常称为植物来源外泌体样纳米颗粒(plant-derived exosome-likenanoparticles，pelns)。pelns是从植物组织中分离得到的一类30～300nm的膜性小泡，含有蛋白质、脂质和核酸等成分。pelns作为植物体的组成部分，对植物自身物质代谢、生理功能维持和病害防御等有重要意义，还可以跨界调控细胞活动，介导不同物种之间的通讯，在生理过程、防病治病和营养供给等环节具有重要作用和应用价值，能够起到疾病干预和药物递送功能。相比于动物外泌体，pelns具有原料来源广泛、容易大规模生产等特点，在生物医药领域展现出广阔的应用前景。

2、pelns的制备主要参照动物外泌体标准来进行，目前分离pelns最常用的方法是超速离心法。超速离心是指转速在30000rpm以上，对应仪器称为超高速冷冻离心机，价格一般在百万元以上。超速离心法整个过程虽然操作简单，但需要大量样本、昂贵的仪器、耗时较长且易存在核糖蛋白和聚集蛋白污染，分离得到的pelns纯度不高，不利于后续pelns研究的开展。此外，在pelns的生物医药应用中，对外泌体的纯度和完整度、外泌体的浓度和产量要求均较高，超速离心法尚不能满足规模化生产的需求。因此，为了克服现有pelns超速离心分离方法的不足，亟待开发一种便携、低成本且能够大规模运用的pelns制备方法，以实现低成本、可重复地制备高产率、高纯度的pelns，保证pelns满足临床转化的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足而提供一种姜黄外泌体及其制备方法与应用，以实现高纯度姜黄外泌体的分离纯化，保证其较高的生物活性，并且操作方法简单易行，能有效降低分离姜黄外泌体的成本。

2、为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

3、第一方面，本发明提供一种姜黄外泌体的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)取新鲜姜黄，打碎榨汁，过滤得到第一上清液；

5、(2)将第一上清液进行差速离心，得到第二上清液；

6、(3)将第二上清液通过微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液；

7、(4)将外泌体初步滤液和聚乙二醇溶液混合后进行孵育处理，得到反应液；

8、(5)将反应液离心，弃上清，重悬沉淀，得到含姜黄外泌体重悬液；

9、(6)将含姜黄外泌体重悬液离心，取上清液；

10、(7)将步骤(6)所得的上清液转移到超滤管中，离心后，将pbs溶液加入所述超滤管中，离心，得到姜黄外泌体。

11、本发明所述的姜黄外泌体制备方法通过差速离心(≤12000rpm)及微孔滤膜进行初步过滤，再通过聚乙二醇沉淀技术沉淀姜黄外泌体，重悬后用超滤管进一步纯化姜黄外泌体，实现了高纯度姜黄外泌体的分离纯化，并且避免了昂贵的超高速冷冻离心机等专业设备以及高成本的商业纯化柱或试剂盒的使用，仅需实验室常见的常规冷冻高速离心机以及价格低廉的微孔滤膜和超滤管，可操作性强，操作方法简单易行，降低了姜黄外泌体的制备成本。

12、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：先在2500rpm-3500rpm条件下离心25-35min，取上清，再在8000rpm-10000rpm条件下离心25-35min，取上清，最后在10000rpm-12000rpm条件下离心20-40min，得到第二上清液，差速离心的温度均为2-6℃。

13、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的最优实施方式，在所述步骤(2)中，差速离心包括如下步骤：先在3000rpm条件下离心30min，取上清，再在10000rpm条件下离心30min，最后在12000rpm条件下离心30min，得到第二上清液，差速离心的温度均为4℃。

14、新鲜姜黄根状茎经过打碎，初步过滤得到第一上清液，此时上清液中含有大量大颗粒物质和细胞碎片等不同密度的杂质组分，通过差速离心有助于实现不同组分的逐步分离，而离心力以及离心时间的控制是让不同杂质组分有效分离的关键，逐步增加合适的离心力可以使得各个杂质组分在适当时间内沉淀到不同位置，从而获得更好的分离效果。本发明经试验探究发现，通过先在2500rpm-3500rpm条件下离心25-35min，取上清，再在8000rpm-10000rpm条件下离心25-35min，取上清，最后在10000rpm-12000rpm条件下离心20-40min三次差速离心(≤12000rpm)，能有效去除上清液中的细胞碎片和大颗粒物，减少杂质对后续外泌体纯化的干扰，同时保留较小的外泌体颗粒物，提高了姜黄外泌体的分离纯化效果；而在3000rpm条件下离心30min，取上清，再在10000rpm条件下离心30min，取上清，最后在12000rpm条件下离心30min三次差速离心的分离纯化效果最佳。

15、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(3)中，所述微孔滤膜过滤包括如下步骤：通过孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，得到外泌体初步滤液。

16、微孔滤膜具有更细微的孔径，可以进一步过滤除去上清液中残留的微小颗粒。本发明通过0.45μm、0.22μm两级微孔滤膜进行初步过滤，能进一步去除残留的固体颗粒、微生物、细胞等微小颗粒，实现姜黄外泌体更彻底的分离和纯化。

17、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述外泌体初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比为1：(0.9-1.2)。

18、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量浓度为15-20％；所述聚乙二醇的分子量为5000-10000。

19、在聚乙二醇沉淀法中，聚乙二醇的分子量和浓度是影响外泌体沉淀效果的重要因素。聚乙二醇的分子量决定了其与生物分子的相互作用力，较高分子量的聚乙二醇会增加与目标生物分子的相互作用，从而促进外泌体的沉淀；聚乙二醇的浓度直接影响外泌体的沉淀效果，较高的聚乙二醇浓度可以促使外泌体形成较大的颗粒，并加速其沉降速度，从而有助于沉淀和分离，而过高的聚乙二醇浓度可能会导致非特异性的沉淀，降低纯化效果。本发明经过大量试验探究发现，当聚乙二醇溶液中聚乙二醇分子量为5000-10000，聚乙二醇的质量浓度为15-20％，且外泌体初步滤液与聚乙二醇溶液的体积比在1：(0.9-1.2)范围内时，姜黄外泌体的纯化效果更佳。

20、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述孵育时间为10-14h。

21、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，步骤(5)的离心条件为：离心转速12000rpm，离心时间60min；

22、步骤(6)的离心条件为：离心转速12000rpm，离心时间10min；

23、步骤(7)的两次离心条件均为：离心转速6000rpm，离心时间15min；

24、在步骤(5)、(6)、(7)中，所述离心温度均为4℃。

25、作为本发明所述的姜黄外泌体制备方法的优选实施方式，在所述步骤(7)中，超滤管采用截留分子量100kd的超滤管。

26、第二方面，本发明提供上述制备方法制得的姜黄外泌体。

27、第三方面，本发明提供上述姜黄外泌体在制备治疗人骨肉瘤药物中的应用。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

29、1、本发明在使用聚乙二醇沉淀技术前后分别通过微滤法和超滤法进行过滤和纯化，起到多重纯化的作用，提高了姜黄外泌体纯度，并且避免了昂贵的超高速冷冻离心机等专业设备以及高成本的商业纯化柱或试剂盒的使用，仅需实验室常见的常规冷冻高速离心机以及价格低廉的微孔滤膜和超滤管，可操作性强，操作方法简单易行，降低了分离姜黄外泌体的成本。

30、2、本发明分离效率高，经鉴定表征，证实了提取的姜黄外泌体具有典型的茶托样或半球样结构和理想粒径(平均粒径为150.9nm)，电荷主要集中在-38.31±0.59mv，浓度为1.7e+11particles/ml，且其蛋白浓度达到8.917μg/μl，纯度极高。

31、3、本发明获得的高纯度姜黄外泌体在一定浓度范围内(2～10μl，蛋白浓度约为17.8～89μg/μl)具有明显的细胞毒性，抑制143b人骨肉瘤细胞的生长。

32、4、本发明获得的高纯度姜黄外泌体显著提高了143b人骨肉瘤细胞中raf1、fas、prkcb三个基因的表达水平，说明其对肿瘤细胞具有明显的生物活性影响。