一种高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法与流程

本发明涉及细胞分离和培养，尤其涉及一种高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法。

背景技术：

1、血管内皮细胞是位于血管内壁的一种具有多种生理功能的单层细胞，可产生和分泌多种生物活性物质，在血管的生物构建、血压调节、抗凝血、维持机体内外环境的平衡等方面具有重要作用。血管内皮细胞受损、功能紊乱是高血压、动脉粥样硬化以及冠心病等多种心血管疾病的始动环节，同时血管内皮功能障碍也是心血管疾病危险因子作用的靶器官，因此保护血管内皮功能成为治疗心血管疾病的新靶点之一。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞功能的重要手段，然而由于种属差异，仅从动物血管中分离内皮细胞远不能满足日益增长的临床转化和靶向药物等研究需求。新生儿脐带取材方便，来源充足，是伦理条件下极少数可以从健康人体获得的健康器官/组织，脐静脉内皮细胞是一种重要的细胞类型，与血管发育、血管功能以及血管疾病等密切相关。高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法可以为研究人类血管疾病提供重要的工具和材料，有助于深入了解血管疾病的发生机制、寻找新的治疗方法。有关人脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelialcells，huvec)分离培养已有报道，传统方法通常需要助手搭档，分离方法因步骤较为繁琐而导致细胞产量低和易污染。

2、因此，继续建立一套步骤简单，便于独立操作、易复制、试剂耗材极简的高效稳定分离培养huvec的方法，将为血管疾病研究、干细胞研究、再生医学、药物研发、个体化医疗和组织工程等领域的研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法，通过免疫荧光细胞化学染色法鉴定内皮细胞标志物的表达，为心血管疾病的发病机制研究奠定基础。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法，包括如下步骤：

4、(1)将脐带清洗至无血液流出；

5、(2)将三通管有环状凸起的一端插入脐静脉，从三通管的另一端注入pbs溶液冲洗脐静脉内壁，剩下一端锁住不让pbs溶液通过，冲洗至流出的pbs溶液澄清为止；

6、(3)将消化酶1注入脐静脉，注入量以消化酶1从脐静脉另一端流出为止，封闭脐静脉，进行第一次消化；

7、(4)所述第一次消化完成后，清洗，将消化酶2注入脐静脉，注入量以消化酶2从脐静脉另一端流出为止，封闭，进行第二次消化；

8、(5)收集第二次消化后的酶解液，分离原代人脐静脉内皮细胞；

9、(6)将所述原代人脐静脉内皮细胞重悬后进行培养，传代，得到纯化的人静脉内皮细胞。

10、优选的，步骤(3)所述消化酶1为胰酶；所述胰酶的浓度为0.20～0.30％。

11、优选的，所述第一次消化的时间为4～6min；所述第一次消化的温度为20～25℃。

12、优选的，步骤(4)所述消化酶2为胰酶；所述胰酶的浓度为0.04～0.06％。

13、优选的，所述第二次消化的温度为35～39℃；所述第二次消化的时间为35～45min。

14、本发明通过建立一套步骤简单、便于独立操作、易复制、试剂耗材极简的高效稳定分离培养huvec的方法，利用免疫荧光细胞化学染色法鉴定内皮细胞标志物的表达，为推动血管疾病研究、干细胞研究、再生医学、药物研发、个体化医疗和组织工程等领域的发展作出重要贡献。本发明采用低浓度胰酶进行消化，具有特性温和、对细胞的损害小、细胞贴壁快、生长较快的特点。

技术特征：

1.一种高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述消化酶1为胰酶；所述胰酶的浓度为0.20～0.30％。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一次消化的时间为4～6min；所述第一次消化的温度为20～25℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述消化酶2为胰酶；所述胰酶的浓度为0.04～0.06％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二次消化的温度为35～39℃；所述第二次消化的时间为35～45min。

技术总结
本发明涉及细胞分离和扩增技术领域，提供了一种高效获得原代人脐静脉内皮细胞的方法：将脐带清洗至无血液流出；将三通管有环状凸起的一端插入脐静脉，从另一端注入PBS溶液冲洗脐静脉内壁，剩下一端锁住不让PBS溶液通过，冲洗至流出的PBS溶液澄清为止；将消化酶1注入脐静脉，注入量以消化酶1从脐静脉另一端流出为止，封闭脐静脉，进行第一次消化；消化完成后，清洗，将消化酶2注入脐静脉，注入量以消化酶2从脐静脉另一端流出为止，封闭，进行第二次消化；收集消化后的酶解液，分离原代人脐静脉内皮细胞；将原代人脐静脉内皮细胞重悬后进行培养，传代，得到纯化的人静脉内皮细胞。本发明将推动血管疾病研究、组织工程等领域的发展。

技术研发人员：李娜,顾颖,胡玲莉,叶扬,李京阳,包正阳,张二云
受保护的技术使用者：无锡市妇幼保健院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15