一种非对称双特异性抗体阴离子交换层析的洗脱方法与流程

本发明属于纯化，具体涉及一种非对称双特异性抗体阴离子交换层析的洗脱方法。

背景技术：

1、双特异性抗体(bispecific antibody，bsab)是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组dna技术制备实现的。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫疾病等领域中具有广阔的应用前景。

2、阴离子交换层析基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中盐浓度或降低洗脱液ph等措施，将吸附在柱子上蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来，结合较强的蛋白质稍后洗脱下来。

3、阴离子交换层析在纯化工艺中纯化模式只要是流穿和结合洗脱模式，大部分单克隆抗体pi值大于7，在中和ph上样条件下大部分蛋白带正电荷，流穿下来。在该步骤中不仅能去除杂质蛋白，聚集体，内毒素，最重要的是能去除病毒，更进一步提高药物的安全性。因大部分病毒在ph＞7缓冲条件下带负电荷，可以和带正电荷的季铵阳离子结合，从而达到消除病毒的作用。

4、对双抗分子来说，大部分抗体pi比单抗低，有的甚至pi能达到5左右，这种pi值较低的双抗分子可以用阴离子结合洗脱模式来纯化。

5、目前双特异性抗体结构越来越多样化，其中非对称型抗体结构最为经典，但这种结构容易引入异源二聚化的问题，异源二聚化是指两条不同的重链可以结合不同的轻链，产生多种类型的抗体，但只有一种双特异性分子是目标抗体，而其他都是非功能性分子，虽然有很多方法可以去除分子量差异为1000da异源二聚体，分子量差异为600da左右的异源二聚体目前较难去除，因为分子量差异为600da左右的异源二聚体，只有通过检测切糖分子量才能识别。虽然在分子设计阶段尽可能通过基因工程手段降低非对称型抗体中错配的产生，但仍不可避免在细胞生产过程中产生的错配的非功能性分子。这就迫切需要一种层析方法，能有效分离分子量差异非常小的目标抗体和错配的抗体。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种非对称双特异性抗体阴离子交换层析纯化方法，在该方法中抗体分子与阴离子填料通过电荷作用力相互结合，使用醋酸缓冲液ph6.5作为平衡液，醋酸-氯化钠缓冲液ph4.5作为洗脱液，通过线性洗脱方式3-50％洗脱液，20个柱体积，从而达到分离结合在阴离子填料上的目标抗体和错配抗体分子的目的。

2、进一步的，在洗脱方法中阴离子平衡液为醋酸缓冲液，该缓冲液ph范围为ph6.0～ph7.0,更优选ph6.3～ph6.8，最优选ph6.5。

3、进一步的，在洗脱方法中阴离子洗脱液选择醋酸-氯化钠缓冲液，该缓冲液ph范围为ph4.0～ph5.0,更优选ph4.3～ph4.8，最优选ph4.5。

4、优选的，在醋酸-氯化钠缓冲液中醋酸浓度优选为40mm～60mm，更优选45mm～55mm，最优选50mm。

5、优选的，在醋酸-氯化钠缓冲液中氯化钠浓度优选200mm～250mm，更优选230mm～250mm，最优选250mm。

6、本发明还提供一种非对称双特异性抗体阴离子交换层析的洗脱方法，包括以下步骤：

7、(1)使用a平衡液平衡阴离子交换层析柱；

8、(2)将含有非对称双特异性抗体的载体，在深层吸附过滤后，装载于阴离子交换层析柱上；

9、(3)使用a平衡液平衡层析柱；

10、(4)使用3％b洗脱液淋洗层析柱；

11、(5)使用a平衡液和b洗脱液洗脱抗体主峰并回收；

12、(6)使用再生液洗脱再生峰。

13、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中a平衡液为醋酸缓冲液。

14、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中a平衡液的用量为1～5个柱体积。

15、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中a平衡液的用量具体可选为3个柱体积。

16、在本发明的一种实施方式中，所述a平衡液ph范围为ph6.0～ph7.0。

17、在本发明的一种实施方式中，优选的，所述a平衡液ph范围为ph6.3-6.8。

18、在本发明的一种实施方式中，优选的，所述a平衡液ph范围具体可选为ph6.5。

19、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中a平衡液中醋酸浓度为40mm～60mm。

20、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(1)a平衡液中醋酸浓度为45mm～55mm。

21、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(1)a平衡液中醋酸浓度具体可选为50mm。

22、在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中使用的载体是含有季铵基团的阴离子填料。

23、本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(2)中使用的载体是琼脂糖基架的强阴离子填料。

24、本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(2)中非对称双特异性抗体为pi值在6.5～8.0之间的knob-into-hole结构的抗体分子。

25、本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(2)中非对称双特异性抗体在载体上的载量为20～40g/l。

26、在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中a平衡液的用量为1～5个柱体积。

27、在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中a平衡液的用量具体可选为3个柱体积。

28、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中b洗脱液为醋酸-氯化钠缓冲液。

29、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中b洗脱液的用量为1～5个柱体积。

30、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中b洗脱液的用量具体可选为3个柱体积。

31、在本发明的一种实施方式中，所述b洗脱液ph范围为ph4.0～ph5.0。

32、在本发明的一种实施方式中，优选的，所述b洗脱液ph范围为ph4.3-4.8。

33、在本发明的一种实施方式中，优选的，所述b洗脱液ph范围具体可选为ph4.5。

34、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中b洗脱液中醋酸浓度为40mm～60mm。

35、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(4)b洗脱液中醋酸浓度为45mm～55mm。

36、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(4)b洗脱液中醋酸浓度具体可选为50mm。

37、在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中b洗脱液中氯化钠浓度为200mm～250mm。

38、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(4)b洗脱液中氯化钠浓度为230mm～250mm。

39、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(4)b洗脱液中氯化钠浓度具体可选为250mm。

40、在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中洗脱方式为a平衡液与b洗脱液呈线性洗脱，洗脱梯度3-50％b，洗脱体积为20个柱体积。

41、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液为醋酸-氯化钠缓冲液。

42、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液中ph范围为ph6.0～ph7.0。

43、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(6)中再生液中ph范围具体可选为ph6.5。

44、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液中醋酸浓度为40mm～60mm。

45、在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(6)再生液中醋酸浓度具体可选为50mm。

46、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液中氯化钠的浓度为0.5-2m。

47、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液中氯化钠的浓度具体可选为1m。

48、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液的用量为1～5个柱体积。

49、在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中再生液的用量具体可选为3个柱体积。

50、本发明所提供的方法在抗体纯化及重组蛋白、疫苗等领域的应用。

51、有益效果：

52、(1)本发明相较于经典抗体平台，阴离子层析步骤多为流穿模式，本发明中阴离子层析步骤为结合洗脱模式，既可以去除聚集体，碎片，宿主蛋白残留以及潜在的病毒，最大优势在于可以高效的将错配的分子和目标分子进行有效分离，从而提高生物学活性。

53、(2)本专利的层析方法可以去除分子量差异为600da左右的异源二聚体。