一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用

本发明涉及基因过程，尤其涉及一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用。

背景技术：

1、泛酸也叫做维生素b5，是一种水溶性维生素。由于水溶性维生素不能被储存在体内，因此，维生素b5只能通过饮食或补品获得。泛酸支持碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢及血红蛋白合成。泛酸的作用之一是帮助蛋白质，碳水化合物和脂肪释放能量。简而言之，维生素b5是身体新陈代谢吃的食物必需的。泛酸是辅酶a的辅基。辅酶a是碳水化合物、脂肪和氨基酸代谢过程中许多可逆乙酰化反应的一个重要辅酶。乙酰辅酶a参与乙酰胆碱、乙酰氨基葡萄糖的合成及甾类化合物的生物合成。对脂肪酸、丙酮酸、α-酮戊二酸以及乙醛等具有氧化作用。丙二酸单酰辅酶a在脂肪酸的生物合成过程中起重要作用。脂酰辅酶a衍生物参与甘油三酯和磷脂的合成。因此，泛酸通过辅酶a在所有细胞代谢中发挥作用。泛酸存在d型和l型两种构型，但仅d型(d-pa)具有生物活性。

2、目前，d-泛酸的生产方法包括物理诱导结晶法、化学拆分法以及微生物法，其中微生物法又包含代谢工程法、发酵法和生物酶法。物理诱导结晶法是将钙化的β-丙氨酸与d,l-泛解酸内酯缩合得到d,l-泛酸钙混合溶液，加入d-泛酸钙晶种诱导结晶拆分d-泛酸钙。物理诱导结晶法工艺成熟，但只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物的生产。化学拆分法是在d,l-泛解酸内酯消旋物中加入奎宁、氯霉胺和麻黄素等化学拆分试剂拆分得到d-泛解酸内酯，再反应得到d-泛酸钙。化学拆分法是目前最主要的合成方法，但拆分剂价格昂贵分离困难，还存在毒性和环境污染问题。酶拆分法利用特异性酶水解d,l-泛解酸内酯消旋物中的l-泛解酸内酯拆分得到d-泛解酸内酯，再反应得到d-泛酸钙。但特异性酶的生产成本较高，导致酶拆分法的生产成本相对较高。

3、随着基因工程技术的发展，使用微生物产d-泛酸因其优势日益受到了人们的广泛关注。利用生物发酵法生产d-泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料、经过生物体自身代谢反应而得到d-泛酸产品，通过合理运用微生物来生产d-泛酸，不仅能够保证泛酸的拆分质量而且还能降低反应成本。相较化学法，生物法具有更加绿色环保的优点。但由于野生型菌株因为自身的细胞经济性，胞内的d-泛酸生物合成途径受限于竞争途径以及辅因子的供给。目前，生物发酵法生产d-泛酸存在发酵产量不高等问题。

技术实现思路

1、为了解决上述生物发酵法生产d-泛酸产量不高的技术问题，本发明提供了一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用。本发明以枯草芽孢杆菌为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备d-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产d-泛酸。

2、本发明的具体技术方案为：

3、一方面，本发明给出了一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：

4、(1)增强alss基因的表达；

5、(2)敲除ilva、lcte、mgsa、yxjf、ywbc、alsd、bdha基因。

6、泛酸是由a-酮异戊酸和l-天冬氨酸两种物质经过四步酶促反应生成。最后在泛酸合成酶的催化下由atp提供能量连接β-丙氨酸和泛解酸生成泛酸。本发明以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备d-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产d-泛酸。对枯草芽孢杆菌进行改造，得到高产d-泛酸的基因工程菌的具体原理为：

7、增强alss基因的表达，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸，从而提高d-泛酸合成；同时，将基因组中的ilva基因敲除，降低支链l-异亮氨酸的合成，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量，进而增加d-泛酸的合成；另外，敲除乳酸途径的基因lcte、mgsa、ywbc基因，通过减少乳酸的积累，使得d-泛酸产量增加；敲除yxjf基因，降低乙酰乙酸合成，使得d-泛酸产量增加；敲除乙偶姻途径中的alsd、bdha基因，通过降低支链有机酸、支链氨基酸的合成，使得d-泛酸产量增加。

8、基于上述原理，对枯草芽孢杆菌进行改造，可以使得枯草芽孢杆菌发酵生产d-泛酸产量增加，构建得到一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

9、其中，上述涉及的基因的序列如下：ilva基因序列如seq id no.2所示，alss基因序列如seq id no.3所示，lcte基因序列如seq id no.4所示，mgsa基因序列如seq id no.5所示，ywbc基因序列如seq id no.6所示，alsd基因序列如seq id no.7所示，bdha基因序列如seq id no.8所示，yxjf基因序列如seq id no.9所示。

10、作为本发明上述技术方案的优选，所述底盘菌为bacillus subtilis atcc 6633。本发明采用基因型为b.subtilis atcc 6633p43-panbpancpand paneilvcilvdseraglya的b.subtilis atcc 6633作为底盘菌进行实验，对本发明技术方案进行验证。该基因型菌株可以以bacillus subtilis atcc 6633为底盘菌，通过公开号为cn114276972a的专利公开的方法进行构建。

11、具体地，本发明底盘菌的构建方法包括以下步骤：

12、(1)以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为底盘菌，运用cre/loxp基因编辑系统

13、将其基因组中的panb基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillussubtilis(p43-panb)；

14、(2)运用cre/loxp基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panb)基因组中的panc基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillus subtilis(p43-panbpanc)；

15、(3)运用cre/loxp基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panbpanc)基因组中的pand基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpand)；

16、(4)运用cre/loxp基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpand)基因组中的pane基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillussubtilis(p43-panbpancpandpane)；

17、(5)运用cre/loxp基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpane)基因组中的ilvc基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillussubtilis(p43-panbpancpandpaneilvc)；

18、(6)运用cre/loxp基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpaneilvc)基因组中的ilvd基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpaneilvcilvd)；

19、(7)运用cre/loxp基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpaneilvcilvd)基因组中的sera基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpaneilvcilvdsera)；

20、(8)运用cre/lox p基因编辑系统将工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpaneilvcilvdsera)基因组中的glya基因的启动子替换为p43启动子，得到工程菌bacillus subtilis(p43-panbpancpandpaneilvcilvdseraglya)，此即为本发明底盘菌。

21、另一方面，本发明还给出了上述高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

22、步骤s1：以枯草芽孢杆菌为底盘菌，增强底盘菌基因组中alss基因的表达；

23、步骤s2：敲除底盘菌基因组中的ilva、lcte、mgsa、yxjf、ywbc、alsd、bdha基因。

24、本发明通过上述步骤s1～步骤s2对枯草芽孢杆菌进行改造，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备d-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产d-泛酸。上述步骤s1～步骤s2的具体原理为：通过步骤s1增强alss基因的表达，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸，从而提高d-泛酸合成；同时，通过步骤s2将基因组中的ilva基因敲除，降低支链l-异亮氨酸的合成，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量，进而增加d-泛酸的合成；另外，通过步骤s2敲除乳酸途径的基因lcte、mgsa、ywbc基因，通过减少乳酸的积累，使得d-泛酸产量增加；敲除yxjf基因，降低乙酰乙酸合成，使得d-泛酸产量增加；通过步骤s2敲除乙偶姻途径中的alsd、bdha基因，通过降低支链有机酸、支链氨基酸的合成，使得d-泛酸产量增加。

25、作为本发明上述技术方案的优选，所述底盘菌为bacillus subtilis atcc 6633。

26、其中，上述步骤涉及的基因的序列如下：ilva基因序列如seq id no.2所示，alss基因序列如seq id no.3所示，lcte基因序列如seq id no.4所示，mgsa基因序列如seq idno.5所示，ywbc基因序列如seq id no.6所示，alsd基因序列如seq id no.7所示，bdha基因序列如seq id no.8所示，yxjf基因序列如seq id no.9所示。

27、作为本发明上述技术方案的优选，增强底盘菌基因组中alss基因的表达的方法为：将alss基因的启动子替换为p43启动子。

28、作为本发明上述技术方案的优选，所述p43启动子的基因序列如seq id no.1所示。

29、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

30、本发明以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，具体地，通过“增强alss基因的表达，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸，从而提高d-泛酸合成；同时，将基因组中的ilva基因敲除，降低支链l-异亮氨酸的合成，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量，进而增加d-泛酸的合成；另外，敲除乳酸途径的基因lcte、mgsa、ywbc基因，通过减少乳酸的积累，使得d-泛酸产量增加；敲除yxjf基因，降低乙酰乙酸合成，使得d-泛酸产量增加；敲除乙偶姻途径中的alsd、bdha基因，通过降低支链有机酸、支链氨基酸的合成，使得d-泛酸产量增加”，基于此，构建得到一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，使枯草芽孢杆菌在发酵制备d-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产d-泛酸。