一种甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化和再生方法

本发明属于细胞工程，具体涉及一种甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化和再生方法。

背景技术：

1、甘蓝型油菜(brassica napus l.)是世界栽培面积第二大的油料作物，因其适应性强、抗病抗逆能力强等优点，也是我国最重要的油料作物之一。不仅可作食用油，其饼粕还可用于动物饲料等食品业和工业加工。目前，传统育种周期长、转化应用慢，已经无法满足生产需求。目前，为了加快加量油菜新品种的释放，细胞融合和基因编辑等依赖原生质体的技术提供了新的育种方向。通过聚乙二醇(peg)介导crispr/cas9质粒瞬转原生质体方法和通过peg介导crispr/cas9蛋白复合体瞬转原生质体方法均可产生非转基因的编辑植株，所以建立在原生质体瞬转的基因编辑技术将成为作物改良的有力工具。

2、目前，根据文献报道，现有的甘蓝型油菜原生质体的再生体系是以甘蓝型油菜的叶片为来源进行是原生质体的分离和培养，进而得到原生质体的再生体系，需培养适合原生质体提取的植株，整个再生周期约20周。并且根据报道可知，采用现有的甘蓝型油菜原生质体的再生方法来获取甘蓝型油菜原生质体的再生体系，均未见完整的再生植株，再生效率低。综上，现有的甘蓝型油菜原生质体的再生方法存在再生效率低和再生周期较长的问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术中甘蓝型油菜原生质体的再生方法存在再生效率低和再生周期较长的问题，本发明以油菜种子发芽的下胚轴为材料，提取原生质体并进行再生。该方法取材方便，后期诱芽率和生根率高，再生周期约15周，为油菜基因编辑育种和细胞融合等提供更多可行的实际案例和方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化和再生方法，其特征在于，包括如下步骤：

4、甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化；

5、培养及再生：将纯化后的甘蓝型油菜原生质体加入m8p+h液体培养基进行培养，培养至出现多次细胞分裂的小细胞团；

6、所述m8p+h液体培养基由下列质量百分比的材料组成：0.005～0.015％二氯苯氧乙酸、0.0005～0.0015％6-苄氨基腺嘌呤、0.0005～0.0015％萘乙酸，不含激素的m8p+nh液体培养基补足100％；

7、将所述细胞分裂后的小细胞团中加入不含激素的m8p+nh液体培养基；继续24～26℃黑暗培养2～3周，直至出现直径<0.5mm的愈伤组织，将其转移到mk3-1固体培养基继续培养2～4周，将>0.5mm的愈伤组织转移到mk3-2培养基上，于光下培养3～5周，直至长出幼芽，待幼芽长至3～5cm高时，将其转移到ms-1培养基上诱导生根，将已生根的幼苗移栽至土壤中，得到原生质体再生植株；

8、所述不含激素的m8p+nh液体培养基由a-大量盐、b-微量盐、c-糖、d-有机酸、e-维生素和f-其他成分组成；

9、e-维生素由下列质量百分比的材料组成：0.024～0.026％肌醇、0.00005～0.00015％烟酸、0.00005～0.00015％盐酸吡哆醇、0.003～0.005％盐酸硫胺、0.0001～0.0003％抗坏血酸，蒸馏水补足100％；

10、f-其他成分由下列质量百分比的材料组成：0.024～0.026％酪蛋白氨基酸、1～3％椰子水，蒸馏水补足100％；

11、所述mk3-1固体培养基和所述mk3-2培养基的组成相似，均由a-大量元素、b-微量元素、c-糖、d-维生素和e-激素组成；其中，所述mk3-1固体培养基中所述e-激素由二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸组成；所述mk3-2培养基中所述e-激素由吲哚-3-乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、玉米素组成。

12、优选地，所述甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化的步骤为：将表面灭菌消毒后的油菜种子播种于mso培养基中进行培养，得到具有4～7cm下胚轴的油菜发芽幼苗；将上述油菜发芽幼苗去除子叶，剪下下胚轴；将下胚轴进行质壁分离，然后加入酶解液，密封后酶解8～12h；

13、于上述培养皿中加入w5 buffer清洗，清洗结束后弃去上清，沉淀物即为原生质体。

14、优选地，油菜种子在mso培养基中进行培养的条件为：于4℃黑暗放置一天，再置于培养箱24～26℃暗培养4-5天；所述mso培养基由下列质量百分比的材料组成：0.220～0.224％ms基础培养基、0.75～0.85％蔗糖、0.65～0.75％琼脂，蒸馏水补足100％。

15、优选地，所述ms基础培养基由无机盐和甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺组成。

16、优选地，加入酶解液的量为3ml～5ml，酶解的条件为：在24～28℃温度下在30～40rpm震荡酶解12～20h。

17、优选地，w5 buffer由下列质量百分比的材料组成：8～10％nacl、0.21～0.23％cacl2.2h2o、0.014～0.016％kcl、0.0027～0.0029％吗啉乙磺酸、0.005～0.015％葡萄糖，蒸馏水补足100％。

18、优选地，原生质体与m8p+h液体培养基混合后对原生质体进行培养的条件为：22～26℃黑暗培养2～5天。

19、优选地，所述c-糖由下列质量百分比为:6.83～6.85％的葡萄糖和0.024～0.026％的蔗糖、d-果糖、d-核糖、d-木糖、d-甘露糖、l-鼠李糖、d-纤维二糖、d-山梨醇、d-甘露醇组成，蒸馏水补足100％；

20、d-有机酸由下列质量百分比为0.001～0.003％的丙酮酸钠和0.003～0.005％的柠檬酸、l-苹果酸、反丁烯二酸组成，蒸馏水补足100％。

21、优选地，将愈伤组织转移到mk3-1固体培养基后，于光下24～26℃培养，15～17h光照，7.5～8.5小时黑暗。

22、优选地，将3～5cm高的幼芽转移到ms-1培养基上2～4周，诱导生根；所述ms-1培养基由下列质量百分比的材料组成：0.220～0.224％ms基础培养基、0.75～0.85％蔗糖、0.65～0.75％琼脂，蒸馏水补足100％。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、1、本发明提供了一种甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化和再生方法。该方法的诱芽率可达90％，生根率可达100％，周期短，约15周可获得健康的原生质体再生植株。本发明所提供的甘蓝型油菜原生质体的分离、纯化和再生方法是采用更具再生能力的下胚轴为外植体，通过纤维素酶和离析酶进行酶解，经过分离纯化、培养、再生诱导芽和根，获得甘蓝型油菜原生质体的再生体系。该方法在油菜生物育种中的应用具有广阔的前景，并为油菜常规育种的提供重要辅助手段，有望在我国油菜杂交种生产和基因编辑种质创制方面发挥重大作用。

25、2、本发明可分离大量高纯度的原生质体，为油菜体细胞融合、单细胞测序、亚细胞定位等研究提供了原生质体分离方法。

26、3、本发明可以为油菜通过原生质体瞬时转化获得基因组编辑植株奠定了基础，为后续油菜生物育种和良种培育的批量生产提供关键技术。

27、4、本发明立足实际，具有重要的创新和应用价值，可广泛应用于甘蓝型油菜基因功能研究和分子育种中，亦可对其他植物原生质体再生系统的建立提供参考，具有广阔的应用前景和技术成果转化潜力。