锌指蛋白及其相关生物材料在调控番茄耐低温性中的应用

本发明涉及生物，特别涉及锌指蛋白及其相关生物材料在调控番茄耐低温性中的应用。

背景技术：

1、随着全球气候频繁骤变，低温冷害已成为限制蔬菜作物生长发育的严重自然灾害，尤其是在北方和高山地区。番茄是全球栽培最为广泛的果类蔬菜之一，具有较高的经济效益，对温度要求较高，易发生冷害。低温是番茄冬春季设施栽培获得稳产、高产与高品质的主要障碍因子，极大地限制了周年生产和供给平衡。

2、栽培种番茄经过长期驯化，遗传背景非常狭窄，丧失了很多优良的抗逆基因，而一些野生材料优异抗性基因的发掘为栽培种抗逆遗传改良提供了可能。从野生材料中挖掘抗逆调控途径的关键基因，并解析这些基因的主要功能和逆境响应机制，是科研人员关注和研究的热点问题。

3、针对低温影响番茄等喜温作物的产量和品质形成的生产实际问题，以及栽培番茄中耐冷基因匮乏、冷响应基因功能研究不深入、低温响应调控机理不清晰等关键问题，本发明为推动栽培种番茄耐低温定向遗传改良、创制新种质提供野生资源优异基因储备，对保障番茄等蔬菜作物周年生产和供给具有十分重要的科学意义和产业价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何提高番茄耐低温能力。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了提高蛋白质活性或含量的物质，或促进或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质的应用，所述应用为下述任一种：

3、p1、在提高番茄耐低温能力中的应用或在制备提高番茄耐低温能力的产品中的应用；

4、p2、在提高与spbzr1的互作进而提高番茄低温胁迫抗性中的应用；

5、p3、在番茄育种中的应用；

6、所述蛋白质为spzfp1，所述spzfp1为如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：

7、a1)氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

8、a2)将a1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)衍生的或与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

9、a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

10、上述应用中，所述蛋白质spzfp1可来源于番茄，具体可来源于醋栗番茄p167。

11、上述应用中，所述番茄育种的目的包括选育耐低温性高的品种。

12、上述应用中，序列表中seq id no.2由259个氨基酸残基组成。

13、上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。

14、上述应用中，所述调控所述蛋白质spzfp1的编码基因可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

15、上述应用中，所述促进或提高所述蛋白质spzfp1的编码基因表达的物质为与所述的spzfp1蛋白相关的生物材料；所述生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：

16、b1)编码所述蛋白质的核酸分子；

17、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

18、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；

19、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

20、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

21、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

22、上述应用中，所述生物材料中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：

23、b1)编码链的编码序列是序列表中seq id no.1的cdna分子或dna分子；

24、b2)核苷酸是序列表中seq id no.3的cdna分子。

25、上述应用中，生物材料b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达spzfp1的核酸分子。该核酸分子不但可包括启动spzfp1基因转录的启动子，还可包括终止spzfp1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

26、可用现有的植物表达载体构建含有所述spzfp1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pcambia1300-gfp、pbi121、pcambia1391-xa、pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白质基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入抗生素的标记基因(如赋予对抗生素潮霉素抗性的基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

27、上述应用中，生物材料中所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

28、为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为w1-w3中的一种或多种：

29、w1提高番茄耐低温能力；

30、w2提高与spbzr1的互作能力。

31、本发明所提供的植物试剂含有所述的spzfp1蛋白或/和所述的spzfp1蛋白相关的生物材料。

32、上述植物试剂的活性成分可为spzfp1蛋白或/和所述的spzfp1蛋白相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据提高番茄耐低温能力的效果确定。

33、为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐低温能力强的番茄的方法。本发明所提供的培育耐低温能力强的番茄的方法，包括将编码所述spzfp1蛋白的基因导入目的番茄中，得到耐低温能力强的番茄；所述耐低温能力强的番茄的耐低温能力强于所述目的番茄的耐低温能力。

34、所述的spzfp1基因可通过农杆菌转化法等常规生物技术方法导入番茄细胞。

35、上述方法中，所述生物材料中，所述基因为下述任一种：

36、b1)编码链的编码序列是序列表中seq id no.1的cdna分子或dna分子；

37、b2)核苷酸是序列表中seq id no.3的cdna分子。

38、上述耐低温能力强的番茄可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

39、上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

40、本发明还保护上述的蛋白质。

41、本发明还保护上述的生物材料。

42、本发明公开了对番茄spzfp1基因进行过表达，提高番茄耐低温性的方法。本发明还验证了敲除番茄spzfp1同源基因降低番茄耐低温性的效果，具体利用crispr/cas9系统对出发番茄中spzfp1基因进行编辑，且使所述spzfp1同源基因发生突变导致翻译蛋白移码或提前终止，得到转基因番茄，实现出发番茄中spzfp1同源基因编辑。本发明还证实了spbzr1和spzfp1二者的相互作用关系，推测spzfp1可能通过与spbzr1互作介导植物激素br协同调节生长发育和低温胁迫抗性。