培养类器官的方法与流程

本发明涉及一种培养类器官的方法。

背景技术：

1、在动物或人类体内测试新药候选物之前，通常使用原代细胞培养物或细胞系进行体外测试。然而，由于细胞培养物不能非常好地模拟体内系统，这种测试的结果可能是不可靠的。这可能导致一些好的药物在体外阶段被舍弃，并且一些不良药物可能会进展到体内试验。

2、类器官是异质性组织的三维结构，其功能类似于体内组织。换句话说，这些组织的三维结构模拟一种器官优于传统的细胞培养单层。因此，类器官提供了创建细胞疾病模型的机会，可以对其进行研究以更好地了解疾病的原因并确定可能的治疗方法。

3、类器官通常由干细胞产生，干细胞可分化为脑、肾、心血管和其他类型的类器官。类器官技术也被用于创建人类结肠癌进展的模型。这些类器官可以从正常的肠细胞进行突变以转化成癌细胞而产生，或者可以从肿瘤细胞本身获得。已经证实从肿瘤中产生的类器官是该原始肿瘤的良好映射，其为改进体外药物测试提供了机会。

4、然而，迄今为止，类器官仅被在实验室环境中进行培养，这严重依赖于相关技术人员的技术技能，并仅产生少量类器官。因此，无法大量提供可应用于药物测试中的类器官。此外，由于依赖于培养过程中的技术技能，培养物之间几乎没有标准化，这意味着对不同批次的类器官进行的测试可能无法直接比较。

5、因此，需要产生大量的类器官，并产生具有一致形式和功能的类器官。这将有助于在药物测试中更广泛地使用类器官，从而提高测试结果的可比性。

技术实现思路

1、因此，本发明提供了一种培养类器官的方法，该方法包括：a)解离未经处理的类器官以产生细胞悬浮液；b)通过细胞过滤器筛选细胞悬浮液以保留含有直径约10μm至约1mm的细胞的经筛选后的细胞悬浮液；和c)将筛选后的细胞悬浮液的细胞接种到在含有细胞外支持基质的细胞培养基中的生物反应器中。细胞悬浮液的筛选提供了特别的优势，即可以控制筛选细胞的尺寸范围。例如，从活跃生长的细胞中挑选窄尺寸范围的细胞接种至细胞培养基中能够得到具有一致的尺寸/表面积与体积比的均质性类器官的培养物，导致可变性降低并且质量得到改善。不受理论束缚，据信可优化细胞/类器官的尺寸以确保所有类器官与细胞外支持基质有良好接触，以及良好的营养物通入和良好的o2张力。这确保了类器官的所有细胞均有适当地发育并且具有高质量，意味着更大数量的类器官可用于各种应用，例如药物筛选。

2、术语类器官仅仅意味着与器官类似。类器官通常通过三个特征定义：自组织、多细胞性和功能性(lancaster和knoblich)。因此，细胞在体外排列成具有体内器官特征的三维(3d)组织，所得结构由在该特定器官中发现的多种细胞类型组成，并且这些细胞至少执行一些其通常在该器官中执行的功能。例如，一种原型类器官如小鼠肠类器官，作为单层上皮细胞生长，并被组织成多个区域，使其类似于体内肠道隐窝-绒毛结构，其包括肠的不同细胞类型(肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞，肠内分泌细胞和干细胞)，并包围一囊腔(sato等)。

3、本发明中，未经加工的类器官是指从组织样品的原代培养物制备得到的类器官，其在培养期间未经过任何筛选或分选的步骤。未经加工的类器官可以分离自组织样品，包括消化道、乳房、前列腺、肺、肝、卵巢、胰腺、皮肤、肾、脑和睾丸的正常或癌症的活检组织。

4、本发明中，未经处理的类器官被解离以将它们分解成(大体上)单细胞。通过过筛后，过滤器上会留下较大的团块。滤液(即筛选的细胞悬浮液)可能主要包含单个细胞和/或两个或更多个细胞的小团块，其直径可以为约10μm至约1mm，优选直径为约10μm至约200μm，更优选直径为约10μm至约60μm。然后将它们接种在包含细胞外支持基质的细胞培养基中。在培养基中进一步生长后，活细胞分裂并成为多细胞类器官(在本发明中称为i阶段类器官)。这些可以从细胞外支持基质中整体“回收”并通过各种尺寸的筛子，以提取所需尺寸范围从约20μm至约200μm的类器官(ii阶段类器官)，如下所述。

5、解离未经加工的类器官可以指使用胰蛋白酶进行细胞解离的过程，胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，其剪切蛋白质，使贴壁细胞彼此之间和/或与培养它们的容器解离。当添加到细胞培养物中时，胰蛋白酶分解蛋白质，使细胞能够粘附到血管上。胰蛋白酶消化通常用于将细胞传递至新血管。作为替代/互补的解离技术，包括edta在内的螯合剂可用于破坏细胞-细胞的连接。

6、细胞培养基是本领域熟知的，并且是技术人员熟悉的。通常，细胞培养基包含氨基酸、盐、葡萄糖和维生素，并且还可包含铁和酚红。适合用于本发明的培养基可以通过改进现有的细胞培养基来产生。例如，细胞培养基可以是达尔伯克改良的伊格尔培养基(dmem)，并且可以包含一种或多种其他组分，如营养混合物(例如ham′s f12)、抗生素/抗真菌剂(例如青霉素/链霉素)、缓冲液(例如hepes)、谷氨酰胺和n-乙酰半胱氨酸。细胞培养基可另外包含无血清补充剂，例如n2补充剂和/或b27补充剂。

7、细胞培养基可包含约1％至约99％v/v的细胞外支持基质，优选约5％至约85％v/v或约10％至约85％v/v的细胞外支持基质。在本发明的较佳实施例中，细胞培养基可包含约85％v/v的细胞外支持基质。与现有技术中通常使用100％细胞外基质相比，减少细胞培养基中的细胞外支持基质的含量可以提供优于现有技术的特定的成本优势。令人惊讶的是，本发明人发现在本发明的方法中，可以降低细胞外基质含量而不损害类器官的生长。

8、较佳地，细胞外支持基质是基于凝胶的细胞外基质，其可以是合成的或天然存在的。可选地或可替代地，细胞外支持基质可以是溶解的基底膜制剂。例如，可以从engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤中提取合适的基底膜制剂，该小鼠肉瘤是富含诸如层粘连蛋白、iv型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、恩他汀/巢蛋白和许多生长因子等细胞外基质蛋白的肿瘤。较佳地，细胞外支持基质包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白和一种层粘连蛋白。在本发明的实施例中，细胞外支持基质可以是matrigeltm(其包含层粘连蛋白、恩他汀和iv型胶原)基质胶或cultrextm基底膜提取物(其包含层粘连蛋白、恩他汀、iv型胶原和硫酸肝素蛋白聚糖)。较佳地，细胞外支持基质是matrigeltm。可选地，细胞外支持基质可以是合成基质，其包含基于纤连蛋白、胶原蛋白和/或层粘连蛋白存在的序列的肽。

9、培养基可以置于细胞外支持基质的顶部，并且可以根据需要除去和补充。在本发明的实施例中，生物反应器提供连续的培养基流，从而连续地供给类器官。培养基的组成可以随时间调整，以最大化地使类器官的均匀生长。

10、将未经加工的类器官解离后获得的细胞悬浮液通过细胞过滤器过筛，以保留如上所述的筛选的细胞悬浮液。筛选的细胞悬浮液的细胞可以是单细胞，或者可以是两个或更多个细胞结合形成的类器官。筛选的细胞悬浮液的细胞或类器官的大小可以通过细胞过滤器的筛孔尺寸来控制。例如，细胞过滤器可具有约10μm至约1mm或约10μm至约500μm的筛孔尺寸。优选地，细胞过滤器的筛孔尺寸为约20μm至约100μm，更优选约30μm至约50μm。在本发明的实施例中，如果在筛选的细胞悬浮液中主要需要单细胞时，细胞过滤器可具有约40μm的筛孔尺寸。合适的细胞过滤器对于技术人员来说是熟悉的并且包括pluristrainers。

11、在筛选未经加工的类器官后，优选将筛选的细胞悬浮液接种到生物反应器中。传统的(二维)细胞培养通常涉及将分离的细胞铺在平面(例如培养皿或组织培养物处理的烧瓶)上并用营养培养基供给细胞。细胞通常在37℃静态储存，暴露于5％co2中。与此相反，生物反应器允许三维的细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，并且提供了生化和物理信号的空间和时间梯度，以及包括不同器官系统之间的对话的系统调节。因此，生物反应器允许细胞分化成三维组织结构，例如类器官。生物反应器的一个关键特征是它们提供动态的培养系统，而不是传统细胞培养的静态培养系统。在静态培养中，质量传递基于扩散，并且由于氧张力的下降和毒性代谢物浓度的增加，通常将组织生长限制为小于0.2mm的厚度。相比之下，生物反应器提供动态的质量传递，这允许组织在毫米至厘米范围内生长。

12、在本发明的实施例中，生物反应器可以是补料分批式生物反应器或灌注式生物反应器，两者都产生培养基流以改善营养物的扩散。补料分批式生物反应器通常提供离散量的培养基，其通常每隔几天更换一次。补料分批式生物反应器可包括搅拌烧瓶式生物反应器或旋转壁式生物反应器，两者都提供培养基的对流以增强营养物的分布。搅拌烧瓶式生物反应器通常使用磁力搅拌棒来产生对流，从而允许培养基的连续混合。旋转壁式生物反应器提供培养基的动态层流。在本发明的优选实施例中，生物反应器是灌注式生物反应器。灌注式生物反应器使用泵系统，其可以以连续或非连续的方式将培养基灌注至细胞或组织。在灌注式生物反应器系统中，通过扩散和对流将氧气和营养物供应到系统内部。可以针对限制性营养物来优化流速，所述限制性营养物主要是氧，因为其在培养基中的溶解度低。灌注式生物反应器可以向类器官提供连续的营养流，发明人已经发现这能够导致类器官生长的改善。

13、灌注式生物反应器可包括进料板生物反应器或流化床生物反应器。进料板生物反应器是本领域技术人员熟知的，一般包括通常由塑料形成的一次性培养皿和一个盖子，所述盖子的一侧具有连续培养基流动的入口端并且另一侧具有连续培养基流动的出口端。基于凝胶的细胞外基质通常覆盖培养皿的底部并包含类器官。进料板生物反应器可以为类器官提供恒定的营养流，本发明人发现这可以改善类器官的生长。不受理论的束缚，本发明人相信使用进料板生物反应器能够使用少于本领域常规使用的细胞外基质培养类器官。生物反应器还可以提高培养过程的效率并且还提供成本优势。

14、进料板生物反应器优选是浅层反应器，例如平板式生物反应器。生物反应器可以是1m×1m或更小的，例如150mm或100mm的平板式生物反应器。在本发明的实施例中，可以使用较小的容器，例如6孔多孔板。可选地，几个生物反应器可以并联或串联连接，并且可以堆叠以提供并联的进料板生物反应器阵列。例如，进料板生物反应器可以包括一组彼此堆叠的生物反应器阵列，使得它们通过输送相同培养基的相同泵并行地供给。

15、在本发明的实施例中，生物反应器可以为类器官提供连续的营养流。营养通常以液体物料的形式提供，例如如上所述的细胞培养基，并且培养基的组分浓度可以随着时间增加或减少，以使类器官的均匀生长最大化。例如，可以从恒定浓度的液体以各种稀释速率连续进料，或从可变浓度的物料恒定进料。在本发明的可选实施例中，营养物可以是脉冲进料的，这意味着液体物料或其他组分的剂量可以以离散的量但以规则的频率添加到生物反应器中。例如，脉冲进料可包括以1分钟或1小时或1天的间隔施加非连续的量的液体物料或培养基。

16、经筛选的细胞悬浮液的细胞可以以约20,000个细胞/ml至约10,000,000个细胞/ml，优选约200,000个细胞/ml至约800,000个细胞/ml，更优选约400,000个细胞/ml至约600,000个细胞/ml的浓度接种到生物反应器中。可以将细胞接种到包含如本发明所述的细胞外支持基质的细胞培养基中。细胞培养基可另外包含一种或多种激酶抑制剂，例如rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。这些抑制剂可以增强种子细胞的恢复和生长。激酶抑制剂可以以约0.1μm至约100μm，优选约1μm至约20μm的浓度存在。在本发明的实施例中，细胞培养基可包含浓度为约10μm的激酶抑制剂。

17、经筛选的细胞悬浮液接种后，优选在生物反应器中培养细胞以形成i阶段类器官。优选产生至少100,000或至少250,000个i阶段类器官。在本发明的实施例中，可以产生大约500,000个i阶段类器官。然而，产生的i阶段类器官的数量可以是约1,000,000个或约5,000,000个或约10,000,000个或更多。可以将类器官培养不少于24小时或不少于36小时。在本发明的实施例中，可以将类器官培养约24至约96小时，优选约36至约72小时。在本发明的优选实施例中，将类器官培养约48小时。

18、通过将细胞培养基/细胞外基质的混合物转移到离心管中并离心，以保留由细胞外基质形成的凝胶层，可以从生物反应器中回收i阶段类器官。然后可以将凝胶层与细胞回收溶液一起孵育，并离心以形成类器官沉淀。

19、细胞回收溶液是本领域熟知的，并且是技术人员熟悉的。细胞回收溶液用于分解细胞外支持基质以释放出类器官并且不造成损坏。合适的细胞回收溶液包括康宁的细胞回收溶液。

20、在从生物反应器中除去i阶段类器官后，优选将类器官(其可以是类器官沉淀的形式)悬浮在细胞培养基中，所述细胞培养基可以包含营养混合物，例如ham′s f12。然后可以通过具有不同筛孔尺寸的至少两个细胞过滤器筛选类器官，以获得直径为约20μm至约200μm的ii阶段类器官的悬浮液。

21、如上所述，类器官的大小可以通过细胞过滤器的筛孔尺寸来控制。例如，细胞过滤器可具有约20μm和约200μm，优选约30μm和约100μm，更优选约40μm和约85μm的筛孔尺寸。具体而言，包含回收的i阶段类器官的悬浮液可以通过具有大筛孔尺寸(例如85μm)的第一细胞过滤器，并且可以丢弃大于该筛孔尺寸的所有类器官。然后，过滤后的内容物可以通过具有比第一细胞过滤器小的筛孔尺寸的第二细胞过滤器(例如40μm)，并且可以丢弃小于该筛孔尺寸的所有碎片。因此通过第一和第二细胞过滤器的筛孔尺寸，可以确定保留的ii阶段类器官的尺寸。在上述实施例中，ii阶段类器官的直径为约40μm至约85μm。

22、ii阶段类器官可以冷冻用于储存或运输。具体而言，可以将ii阶段类器官重悬于冷冻培养基中，浓度为每200μl冷冻培养基中约10,000至约500,000个类器官，优选每200μl冷冻培养基中约20,000至约300,000个类器官，更优选每200μl冷冻培养基中约50,000至约100,000个类器官。然后可将悬浮的类器官在-80℃下冷冻。

23、冷冻培养基对于本领域技术人员来说是熟悉的，通常包含细胞培养基和二甲基亚砜(dmso)的混合物，可选地还包括胎牛血清(fcs)。合适的冷冻培养基可通过商购获得，包括gibco recovery cell culture freezing medium。