一种基于实时荧光PCR的肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的精准定量检测方法及应用

本发明涉及检验检测，具体为一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的精准定量检测方法及应用。更具体地，本技术提供一种基于实时荧光pcr的牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的精准定量检测方法及应用。

背景技术：

1、随着人类生活水平不断提高和对健康饮食的追求，人类的肉食消费结构逐渐发生变化，高蛋白、低脂肪、低胆固醇的牛羊肉的消费比例显著上升。

2、目前，肉类行业掺假的检测标准只有定性的检测方法，无法区分恶意掺假和无意污染，在肉类食品生产、运输、贮藏过程中，不同肉类相互接触、共用加工工具、共用生产线，而污染的肉类食品会被定义为“掺假肉”。牛肉食品中同时定量检测猪、鸡、鸭源性成分的方法未见报道。因此，急需建立一种稳定、准确、快速的定量检测方法，能精准定量牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的含量，为执法部门提供更准确的检测结果，做到不错查、不漏查，促进肉类食品行业的健康发展。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于，提供一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr定量检测方法及应用。本发明方法可量化牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的含量，区分恶意掺假和无意污染，打击肉源掺假，促进肉类食品行业的健康发展。

2、为了实现上述目的，本发明采用技术方案如下：

3、一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr精准定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

4、(1)设计牛、猪、鸡、鸭标记基因的上游引物、下游引物及探针

5、(2)分别提取牛、猪、鸡、鸭标准物质及测试样品的dna；

6、(3)将步骤(2)提取的牛、猪、鸡、鸭标准物质dna进行稀释，分别配制一系列拷贝数浓度梯度的标准溶液，以标准溶液为模板进行实时荧光pcr扩增，测量每组标准溶液的ct值，绘制牛、猪、鸡、鸭标准曲线y＝ax+b，其中，y是测试样品的ct值，a是标准曲线的斜率，x是模板拷贝数以10为底数的对数，b是标准曲线的截距；

7、(4)以步骤(2)提取的测试样品的dna为模板，进行实时荧光pcr扩增；获得测试样品的ct值，根据步骤(3)中绘制的标准曲线，计算获得测试样品中牛、猪、鸡、鸭标记基因的拷贝数；

8、(5)根据公式计算测试样品中动物源性成分的百分含量，其中c是测试样品中待测动物成分的百分含量，nd是测试样品中待测动物标记基因拷贝数，nz是测试样品中所有动物标记基因拷贝数之和。

9、在一个实施方式中，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光pcr的扩增引物和探针为：

10、牛的上游引物bos-f：ccctcgcccgcattg；

11、牛的下游引物bos-r：agcgacaggtcaagggagtca；

12、牛的探针bos-p：vic-cagctcaactcttagcc-bhq1；

13、猪的上游引物sus-f：gcaaggccagggatcga；

14、猪的下游引物sus-r：agcagaaaccagccatggatt；

15、猪的探针sus-p：fam-ccgcgtcctcatgg-bhq1；

16、鸡的上游引物gal-f：cgtccctcacttccatattgatg；

17、鸡的下游引物gal-r：atcttcactgtcaatgccttcaca；

18、鸡的探针gal-p：cy5-cctctttgtggatcctgt-bhq3；

19、鸭的上游引物ana-f：cagtcccccctgcctagga；

20、鸭的下游引物ana-r：tcagtgtacaggtagcccctctct；

21、鸭的探针ana-p：texas-aagtgccagtatgcggg-bhq2。

22、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述牛的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，bos-f和bos-r引物各1.0μl，bos-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。

23、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述猪的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，sus-f和sus-r引物各1.0μl，sus-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。

24、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述鸡的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，gal-f和gal-r引物各1.0μl，gal-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。

25、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述鸭的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，ana-f和ana-r引物各1.0μl，ana-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。

26、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光pcr反应条件为：第一阶段95℃、5min；第二阶段95℃、10s，62℃、30s，循环数为40；在第二阶段的退火延伸时段收集荧光信号。

27、在一个实施方式中，本发明提供一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr定量检测方法的应用。

28、在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6中的引物和探针。

29、在一个实施方式中，所述权利要求1-6中的引物和探针在制备实时荧光pcr定量检测肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的试剂盒中的用途。

30、综上，本发明以核基因组单拷贝基因为标记基因，建立的肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的定量检测方法特异性高、准确度高、灵敏度高，其中牛、猪、鸡、鸭的定量限均为0.1％，检出限分别为5、5、5、10个拷贝。应用本发明方法对34份商业肉类食品的肉源成分进行定量检测，检测结果与标签标识进行比对，发现部分定性标识的牛肉产品中牛肉含量极低甚至不含有牛肉，且检出未标识的肉源成分；极少数定量标识的牛肉产品中牛肉含量没有达到标识含量。

31、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

32、1.本发明的标记基因为牛、猪、鸡、鸭核基因组单拷贝基因tumor necrosisfactor receptor superfamily member10a(tnfrsf10a)、prion protein(prnp)、transforming growth factor beta 3(tf-gb3)、beta-actin基因，核基因组单拷贝基因在动物细胞核中单一存在，标记基因拷贝数可代表动物细胞数。现有技术大多以线粒体基因为标记基因，动物细胞中线粒体的数量差异较大，以线粒体基因为标记基因建立的定量检测方法准确度较差。

33、2.本发明建立的肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr精准定量检测方法基于taqman探针，较染料法特异性更强。

34、3.本发明建立的肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr精准定量检测方法为一种绝对定量方法，而现有技术大多为相对定量方法。绝对定量方法不依赖内参基因，分别对待测动物肉源标记基因的拷贝数进行绝对定量，对肉源成分单一或复杂的食品都可实现精准检测。

35、4.与现有技术相比较，本发明根据欧盟标准engl，2015进行了特异性、准确度、定量限和检出限的测试，测试结果显示：本发明特异性高、准确度高、灵敏度高。通过对商业肉类食品的定量检测，说明本发明方法可量化牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的含量，为肉类食品行业的健康发展提供技术支撑。