水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记、试剂盒和应用

本发明属于分子标记，尤其涉及水稻光温敏雄性核不育kasp分子标记、试剂盒和应用。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，养活了世界三分之一人口。基于光温敏雄性核不育系的两系法杂交稻在当今中国水稻生产中占据重要位置。选育遗传背景丰富、综合农艺性状良好的光温敏雄性核不育系是杂交稻发展的主要方向。相较于传统育种方式，分子标记辅助选择技术通过在水稻苗期进行dna水平上的鉴定和定向选择，避免了传统育种中耗时久、表型精确鉴定难等弊端，有效提高了水稻品种选育的效率，提高了复杂性状改良的可能性，节省了土地、人力、时间成本，是分子育种的主要技术手段之一，是实现“精确育种”的基础。

2、相较于传统的通过水稻田间表型判断其育性的方法，如抽穗期花粉镜检和套袋收获后结实率检测，使用分子标记辅助选择可在苗期进行大规模的高效筛选，节省时间和田间种植成本。分子标记辅助选择具有更高的准确率，避免了因串粉造成高结实率而误判水稻单株的育性。分子标记检测不受环境影响，避免了因突发低温天气、日长变化造成光温敏不育系结实而误判水稻单株的育性。目前，针对光温敏雄性核不育基因开发了caps分子标记，但需经pcr扩增、数小时甚至过夜酶切再跑胶检测，繁琐耗时长、检测效率低；所用的聚丙烯酰胺、甲醛、琼脂糖凝胶染料、跑胶缓冲液等有毒有害试剂危害人体健康且污染环境；只能检测单个光温敏不育基因携带情况；无法满足高通量检测的要求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种安全环境友好的、快捷高效、可大规模高通量同时检测两系杂交稻生产上使用的所有光温敏雄性核不育基因的kasp分子标记及其试剂盒，能够用于检测区分水稻品种是否携带光温敏不育基因tms5和pms3，辅助水稻两系不育系的高效选择、改良及不育系繁制种中种子纯度检测。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种水稻光温敏雄性核不育kasp分子标记，包括以下两组引物：组1引物包括核苷酸序列分别如seq id no.1-3所示的tms5-kasp-fam、tms5-kasp-hex和tms5-kasp-r；组2引物包括核苷酸序列分别如seq id no.4-6所示的pms3-kasp-fam、pms3-kasp-hex和pms3-kasp-r。

4、本发明还提供了上述kasp分子标记在制备鉴定水稻光温敏雄性核不育系产品中的应用。

5、优选的，所述产品包括试剂盒。

6、本发明还提供了一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的试剂盒，包括上述的kasp分子标记。

7、优选的，所述组1引物中tms5-kasp-fam、tms5-kasp-hex和tms5-kasp-r的摩尔浓度比为12:12:30；所述组2引物中pms3-kasp-fam、pms3-kasp-hex和pms3-kasp-r的摩尔浓度比为12:12:30。

8、优选的，所述试剂盒还包括阳性对照模板dna和阴性对照，所述阳性对照模板dna的核苷酸序列分别如seq id no.7-10所示。

9、本发明还提供了上述kasp分子标记或上述试剂盒在鉴定水稻光温敏雄性核不育系中的应用。

10、本发明还提供了一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的方法，包括如下步骤：以待测水稻基因组为模版，采用上述的kasp分子标记或上述试剂盒对模板进行pcr扩增，扩增结束后进行荧光数据快速读取和基因聚类分型；

11、检测结果判定为：若样品发荧光的圆点分布靠近x-fam轴，则判断该水稻样品为纯合野生型可育株；若样品发荧光的圆点分布靠近y-hex轴，则判断该水稻样品为纯合突变型光温敏雄性核不育株；若样品发荧光的圆点分布靠近x-fam轴与y-hex轴的对称区域轴，则判断该水稻样品为杂合型可育株。

12、优选的，所述pcr扩增的体系以10μl计，包括样品dna模板5μl，kasp pcr mix 4.86μl和引物0.14μl。

13、优选的，所述pcr扩增的程序为：94℃15min，1个循环；94℃20s，62℃，每经历一个循环降低0.6℃，60s，10个循环；94℃20s，56℃60s，28个以上循环。

14、本发明的有益效果：

15、本发明相较于传统的田间表型判断水稻育性的方法，可在苗期进行大规模的高效筛选，节省时间和田间种植成本；具有更高的准确率，避免了因串粉造成高结实率而误判水稻单株的育性。本发明提供的分子标记检测不受环境影响，避免了因突发低温天气造成温敏不育系结实而误判水稻单株的育性。相较于ssr、caps等传统pcr分子标记，本发明kasp标记检测不依赖酶切、凝胶电泳等繁琐耗时步骤，检测效率高，重复性好，可高通量规模化筛查(每2-5秒钟可完成94或382个样本的荧光数据读取和基因分型)。无需使用eb、tae、tbe、聚丙烯酰胺、甲醛等危害人体健康，污染环境的有毒有害试剂。本发明相较于测序，更便宜、仪器设备要求低。本发明相较于单一光温敏核不育基因检测分子标记，可一次检测目前两系不育系生产上使用的所有光温敏不育基因，辅助选育聚集多个光温敏不育基因的、不育起点温度更低、育性更稳定的不育系。

技术特征：

1.一种水稻光温敏雄性核不育kasp分子标记，其特征在于，所述kasp分子标记包括以下两组引物中的至少一种：组1引物包括核苷酸序列分别如seq id no.1-3所示的tms5-kasp-fam、tms5-kasp-hex和tms5-kasp-r；组2引物包括核苷酸序列分别如seq id no.4-6所示的pms3-kasp-fam、pms3-kasp-hex和pms3-kasp-r。

2.权利要求1所述kasp分子标记在制备鉴定水稻光温敏雄性核不育系产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒。

4.一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的kasp分子标记。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述组1引物中tms5-kasp-fam、tms5-kasp-hex和tms5-kasp-r的摩尔浓度比为12:12:30；所述组2引物中pms3-kasp-fam、pms3-kasp-hex和pms3-kasp-r的摩尔浓度比为12:12:30。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照模板dna和阴性对照，所述阳性对照模板dna的核苷酸序列分别如seq id no.7-10所示。

7.权利要求1所述kasp分子标记或权利要求4-6任意一项所述试剂盒在鉴定水稻光温敏雄性核不育系中的应用。

8.一种鉴定水稻光温敏雄性核不育系的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测水稻基因组为模版，采用权利要求1所述的kasp分子标记或权利要求4-6任意一项所述试剂盒对模板进行pcr扩增，扩增结束后进行荧光数据快速读取和基因聚类分型；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的体系以10μl计，包括样品dna模板5μl，kasp pcr mix 4.86μl和引物0.14μl。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序为：94℃15min，1个循环；94℃20s，62℃，每经历一个循环降低0.6℃，60s，10个循环；94℃20s，56℃60s，28个以上循环。

技术总结
本发明提供了水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记、试剂盒和应用，属于分子标记技术领域。本发明提供的水稻光温敏雄性核不育KASP分子标记，包括组1引物tms5‑KASP‑FAM、tms5‑KASP‑HEX、tms5‑KASP‑R；组2引物pms3‑KASP‑FAM、pms3‑KASP‑HEX、pms3‑KASP‑R的至少一种。本发明应用时安全环境友好、快捷高效、可大规模高通量同时检测两系杂交稻生产中使用的水稻光温敏雄性核不育基因tms5和pms3，能够用于检测区分水稻品种所携带光温敏雄性核不育基因，辅助水稻两系不育系的高效选择、改良及不育系繁制种中种子纯度检测。

技术研发人员：董维,李小林,谷安宇,奎丽梅,涂建,徐雨然,安华,管俊娇,蓝舵,杨丽萍,吕莹,陈忆昆
受保护的技术使用者：云南省农业科学院粮食作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6