一种抑制产气荚膜梭菌的植物乳杆菌及其后生元和应用的制作方法

本技术涉及微生物领域，具体涉及一种抑制产气荚膜梭菌的植物乳杆菌及其后生元和应用。

背景技术：

1、在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。

2、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens,cp)是一种厌氧性细菌，能产生多种毒素，引起人和动物的多种疾病，如气性坏疽、食物中毒、坏死性肠炎等。根据产生的外毒素种类和致病性的不同，产气荚膜梭菌可以分为a、b、c、d、e五个型。a型：是最常见的型别，能产生α、β、θ和ε四种毒素。α毒素是最重要的毒素，能分解卵磷脂，损伤细胞膜，引起溶血和组织坏死。a型主要引起人类和动物的气性坏疽、胃肠炎型食物中毒和坏死性肠炎。由产气荚膜梭引起的坏死性肠炎(necrotic enteritis,ne)是全球家禽业中最重要的肠道疾病之一，每年造成约6-7亿美元的损失。产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性杆状细菌，可形成孢子，是引起家禽临床和亚临床坏死性肠炎的主要病原体。ne发展的关键因素是胃肠道环境的变化，这为cp的生长创造了有利条件。目前，对cp的防治主要依赖于抗生素和疫苗，但由于抗生素的滥用和耐药性的增加，以及疫苗的保护效果不理想，这些方法存在很大的局限性和风险。

技术实现思路

1、本发明提供了一株植物乳杆菌，该菌具备良好的抑菌活性，尤其是对多种产气荚膜梭菌具备优异的抑制效果，同时本发明提供了该菌的后生元，该菌的后生元也具备优异的抑菌性能，能够良好的应用到产气荚膜梭菌导致的疾病中比如坏死性肠炎的防治中。

2、具体地，本发明提供了下述的技术方案。

3、在本发明的第一方面，提供了一株植物乳杆菌，其命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072，该菌株已于2023年05月29日保藏于位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2023842。

4、本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072具备良好的生长能力，特别是在ph2.5～8.5的环境下依然能够正常生长，其中，ph2.5条件下4h的存活率为0h时的61.11％；在ph4.5、6.5、8.5条件下4h活菌数均有明显提升，ph8.5条件下4h的存活率是0h时的1321％，这说明本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072具有优异的耐酸、耐碱性能。

5、以及，本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072的抑菌谱广泛，对大肠杆菌(禽源、兔源、猪源等)、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、肠炎沙门氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、产气荚膜梭菌(禽源、猪源等)和鸡白痢沙门氏菌等常见畜禽病原菌均具有良好的抑菌效果，并且本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072在灭活(121℃处理30min)处理后，其依然对上述常见畜禽病原菌具备良好、甚至更好的抑菌效果。

6、在本发明的第二方面，提供了上述第一方面中所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072的发酵物。所述发酵物比如可通过将本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072接种于微生物培养基中培养获得。

7、在本发明的第三方面，提供了上述第一方面中所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072的后生元，其包含：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072和/或其发酵代谢产物。

8、本发明所述后生元(postbiotic)是由益生菌(在本发明中为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072)经过灭活或加工后得到的无生命微生物和/或其成分，主要包括菌体与菌体的代谢产物。在本发明中，所述后生元具有一些益生菌的功能而又不需要活菌的存活和定殖，因此更稳定、安全和具有良好的耐受性。

9、特别是，在本发明的实施方式中，本发明所述后生元具有与植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072相当甚至更好的抑菌活性，特别是针对产气荚膜梭菌。

10、在本发明的一些实施方式中，后生元中植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072的细胞数不低于4.0×1010cfu/g。

11、在本发明的一些实施方式中，本发明所述的后生元，其组成中至少还含有乳酸、乙酸、脂磷壁酸和肽聚糖，比如，在本发明的一些实施方式中，后生元中具备高含量的乳酸、脂磷壁酸、肽聚糖等物质，其中，乳酸、乙酸含量分别不低于120g/kg、14.0g/kg，脂磷壁酸、肽聚糖含量分别在200mg/g、2.00mg/g以上，优选脂磷壁酸、肽聚糖的含量分别在230mg/g、2.10mg/g以上。

12、在本发明的一些实施方式中，本发明所述后生元通过将植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072的发酵液喷雾干燥获得；在一些优选的实施方式中，所述后生元通过将植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072的发酵液中添加糊精后喷雾干燥获得；其中，喷雾干燥的温度为180～220℃，糊精的加入量为5～15％(w/v)，优选为10～15％。

13、在本发明的第四方面，提供了一种制备上述第三方面中所述的后生元的方法，其包括：将植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072的发酵液进行灭活处理和/或喷雾干燥。

14、在本发明的一些实施方式中，灭活处理的条件为121℃处理15～30min。

15、在本发明的一些实施方式中，喷雾干燥的温度为180～220℃。

16、在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072的发酵液进行灭活处理和/或添加5～15％(优选10-15％)的糊精喷雾干燥。

17、比如，在本发明的一个实施方式中，所述方法包括：将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072接种至斜面37℃培养20h，转接至mrs液体培养基37℃培养20h，121℃处理30min，在发酵液中添加12％(w/v)的糊精喷干(进风口温度210℃、出风口温度100℃)制备得到后生元。

18、在本发明的一些实施方式中，特别是在放大的生产工艺中，比如在以500l发酵罐进行的中试试验中，所述方法包括：接种培养植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072，发酵过程中ph自然不调控，发酵结束后，发酵液中直接添加5～15％(优选10-15％)的糊精喷雾干燥(进风口温度210℃、出风口温度100℃)制备得到后生元。

19、将本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072制备成后生元的工艺简单，仅需将菌株发酵液灭活和/或喷干即可，尤其在大生产中无需调节ph，只需在发酵液中添加5～15％的糊精在180～220℃喷雾干燥即可制备得到后生元产品。

20、如前文中所述的，在本发明所述后生元(postbiotic)是由益生菌(在本发明中为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072)经过灭活或加工后得到的无生命微生物和/或其成分，主要包括菌体与菌体的代谢产物。本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072后生元具备良好的抑菌能力、能够良好的应用到产气荚膜梭菌导致的疾病比如坏死性肠炎的防治中，并且还能够增强蛋鸡对病原体的防御能力和提高鸡蛋品质包括增强蛋鸡的免疫反应、改善蛋鸡的肠道健康和优化蛋鸡的营养吸收等，这表明本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072后生元能对宿主产生有益的生理效应。其制备工艺简单表明该菌株能够在简单的制备过程中制备后生元，具有较高的生产效率，可在较短的时间内或在较低的资源投入下制备后生元；制备工艺简单还意味着制备的后生元具有较好的稳定性，能够在不需要复杂的处理或保存技术的情况下保持其有效性；制备工艺简单能够降低生产成本，使得利用该菌株制备后生元更为经济，具有良好的经济效益。

21、在本发明的第五方面，提供了一种组合物，其包含上述第一方面中所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072或其发酵液或其后生元。所述组合物比如为菌剂、饲料添加剂或包含该菌剂或饲料添加剂的饲料，或者为微生态制剂等等。

22、比如，在本发明的一些实施方式中，提供了一种菌剂，其包括植物乳杆菌blcc2-0072菌泥和冻干保护剂。所述冻干保护剂比如脱脂奶粉等，比如在一个实施方式中，所述冻干保护剂由脱脂奶粉20份、蔗糖5份和水100份组成。菌泥与冻干保护剂的比例比如可以为体积比1:1。

23、在本发明的一些实施方式中，所述菌剂的制备方法包括：发酵植物乳杆菌blcc2-0072后离心收获菌体(菌泥)，将菌泥与等体积的冻干保护剂混合、真空冷冻干燥，制成菌粉，即得。

24、在本发明的第六方面，提供了上述第一方面中所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072或其后生元或上述第五方面中所述的组合物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：

25、1)在制备具有抑菌功能的产品中的应用；比如，在本发明的一些实施方式中，所述抑菌功能包括对选自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、肠炎沙门氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、产气荚膜梭菌、鸡白痢沙门氏菌中的细菌具有抑制作用；

26、2)在制备预防和/或治疗与产气荚膜梭菌感染相关的疾病的产品中的应用；比如，在本发明的一些实施方式中，所述与产气荚膜梭菌感染相关的疾病包括禽坏死性肠炎和仔猪梭菌性肠炎；

27、3)在制备防治禽坏死性肠炎的产品中的应用；

28、4)在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用；比如，在本发明的一些实施方式中，所述调节肠道菌群为调节禽类肠道菌群，包括提高粪便中乳酸菌(比如乳球菌、乳杆菌)的数量，以及降低大肠杆菌数量；

29、5)在制备用于提高蛋鸡产蛋品质的产品中的应用；比如，在本发明的一些实施方式中，所述提高蛋鸡产蛋品质包括提升单枚蛋重、加深蛋黄颜色和提高蛋壳厚度；和

30、6)在制备增强蛋鸡免疫功能的产品中的应用；比如，在本发明的一些实施方式中，所述增强蛋鸡免疫功能包括提高蛋鸡及鸡蛋中卵黄新城疫(nd)抗体和重组禽流感(h5-14)抗体的抗体滴度。

31、在本发明的一些实施方式中，所述产品为饲料、菌剂、微生态制剂。

32、在本发明的一些实施方式中，所述产品主要应用于禽类或猪，所述禽类尤其指鸡，特别是蛋鸡。

33、在本发明的第七方面，提供了一种抑制细菌的方法，包括向待抑菌物施用上述第一方面中所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072或其后生元或包含该菌或其后生元的组合物以实现对细菌的抑制，所述细菌选自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、肠炎沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和产气荚膜梭菌。

34、在本发明的一些实施方式中，所述产气荚膜梭菌尤其为a型产气荚膜梭菌。

35、在本发明的一些实施方式中，本发明所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072或其后生元能够对不同来源的a型产气荚膜梭菌均具有良好的抑制作用，比如，本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072可同时抑制禽源a型产气荚膜梭菌和猪源a型产气荚膜梭菌，它们在一些基因序列和毒力因子方面往往存在差异，因此会表现出不同的特性和病原性，此外，由于它们在不同宿主中的生活环境和暴露源会有所不同，这些因素可能导致它们在生物学特性、耐药性和病原性上也会存在差异。比如，禽源a型产气荚膜梭菌可引起家禽的坏死性肠炎，猪源a型产气荚膜梭菌可导致仔猪坏死性肠炎。本发明所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072可同时抑制禽源a型产气荚膜梭菌和猪源a型产气荚膜梭菌，因而具备同时应用于禽类和家猪的潜力。

36、在本发明的第八方面，提供了一种防治坏死性肠炎的方法，其包括向受试者施用有效量的上述第一方面中所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072或其后生元或包含该菌或其后生元的组合物。

37、在本发明中，所述“受试者”是指已经是或将要是治疗、观察或实验对象的动物，如家禽、哺乳动物等，比如鸡、猪、人等。本文描述的方法可用于人的治疗和/或兽医应用。在本发明中，优选地受试者为鸡或猪。

38、在本发明中，所述“有效量”是指施用本发明所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0072或其发酵物或其后生元或者包含该菌或其后生元的组合物或产品能够引发受试者生物或医疗响应并足以有效地缓解机体不良状态、病症或紊乱等的量。所述有效量可以由考虑到自身知识、现有技术水平和本领域技术人员常规地确定，比如通过体内、体外或离体实验确定或展示该量。

39、相较于现有技术，本发明的优势包括：

40、本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072，其具备良好的抑菌性能，能够对多种病原菌产生抑制作用，特别是对不同来源的a型产气荚膜梭菌表现出优异的抑制效果。同时本发明提供了植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)blcc2-0072的后生元，该后生元也表现出优异的抑菌作用，并且该后生元能够有效地防治坏死性肠炎，能够保护或缓解cp导致的肠黏膜损伤、肠道菌群改变等等，并且能够降低攻毒期间的料肉比以及改善蛋鸡产蛋品质、增加卵黄中多种抗体的水平，特别是，后生元的制备工艺简单，易于放大，且工艺稳定，尤其是在放大工艺中无需额外进行灭活处理，具有良好的经济效益。