一种用于生产制备9α-OH-BA的基因工程菌株、及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及一种高产9,21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(9α-oh-ba)菌株的构建方法与应用。

背景技术：

1、甾体化合物(简称甾体)，又称类固醇化合物，是一类具有“环戊烷多氢菲”结构的萜脂类化合物。因其不同位点上官能团的修饰而具备不同的药物活性，目前已成为仅次于抗生素的第二大类药物。基因工程的发展推进了微生物甾体代谢机制的研究，同时产生了很多合成甾体中间体的基因工程菌株。其中，分枝杆菌由于具有高效快速降解植物甾醇的能力，被许多研究单位和甾体生产厂家作为主要的研究对象，经过代谢通路改造后可以积累一些重要中间体，如ad、ba、9-ohad、9α-oh-ba等。

2、在植物甾醇生物转化过程中，由于甾醇侧链不能完全降解，c19和c22产物会同时积累，因此，固醇代谢途径可分为c19和c22代谢分支。近年来，有大量文献报道积累c19甾体化合物(ad、9-ohad等)的基因工程菌，与之相比，c22甾体化合物(ba、9α-oh-ba等)的研究相对较少。其中，9α-oh-ba(9,21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮)是一种新型的甾体类药物中间体，其结构的特性，与c19类甾体化合物两者相比，更适合作为原料黄体酮、氢化可的松、地塞米松和屈螺酮等孕激素和肾上腺皮质激素，具有极高的经济价值。因此，获得高效产9α-oh-ba生产菌株一直是人们研究的热点。

3、17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶(hsd4a)是位于植物甾醇代谢途径分叉的关键酶，可在侧链降解过程中将22-羟基-3,24-二氧基-4-烯-胆固醇-coa(22oh-bnc-coa)转化为3,22,24-三氧基-4-烯-胆固醇-coa(22-oxo-bnc-coa)；因此，hsd4a活性的减少会促进反应代谢流向c22通路。据文献报道，m.neoaurum nwib-xii积累了c19类固醇(ad,add和睾酮)，而改造后的m.neoaurum nwib-xiiδhsd4a积累了c22类固醇1,4-ba和ba作为最终产物(doi:10.1038/srep21928)。另外，研究发现敲除fada5的突变株可以积累c22中间产物(doi:10.1186/s12934-021-01717-w)。除了hsd4a调控c19和c22途径的固醇代谢流外，一种双作用还原酶mnopccr(本研究命名为opccr)也能将3-opc-coa和3-opa还原为ba(doi:10.1002/anie.202015462)。因此，hsd4a、fada5和opccr是积累9α-oh-ba基因改造菌株的重要酶标靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于生产制备9α-oh-ba的基因工程菌株。所述基因工程菌中，是将出发菌株中的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和硫酯酶fada5的编码基因失活。生产菌株的出发菌株为放线菌。

2、优选地，所述的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和硫酯酶fada5的编码基因具有seq id no:1、seq id no:2所示核酸序列，其中这两个基因的失活或敲除可以通过crispr或同源重组等常用技术手段实现。

3、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的基因工程菌中，所述的放线菌是分枝杆菌。作为本发明的某些实施方式，本发明所述的基因工程菌中，所述放线菌是偶发分枝杆菌m.fortuitum mfδkstd(见专利：202310039555.6)。

4、在出发菌株mfδkstd中敲除hsd4a和fada5后，实现9α-oh-ba的稳定积累。最终，改造后的偶发分枝杆菌9α-oh-ba的产量达5.88g/l，摩尔产率为70.70％。将杂质9-ohad含量从4.34％降低到1.21％，9α-oh-ba含量从81.58％提高到91.58％。

5、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供所述的基因工程菌在发酵生产9α-oh-ba中的应用。

6、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的应用中，所述发酵生产的发酵培养基含有玉米浆干粉10-20g/l，葡萄糖8-15g/l，磷酸氢二铵0.5-1g/l，硝酸钠5-8g/l，吐温801-3g/l。作为本发明的某些实施方式，所述发酵培养基含有玉米浆干粉15g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二铵0.7g/l，硝酸钠6g/l，吐温80 2.0g/l，按1:3质量比混合的植物甾醇与羟丙基-β-环糊精10～30g/l，ph为7-8。作为本发明的某些实施方式，所述发酵培养基含有按1:3质量比混合的植物甾醇与羟丙基-β-环糊精10g/l。

7、优选的，所述发酵培养基中的植物甾醇预先按照一定比例与羟丙基-β-环糊精混合搅拌并超声处理至均匀状态，然后添加到培养基中。更优选地，植物甾醇与羟丙基-β-环糊精的质量比为1:3。

8、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的应用中，所述发酵生产的条件为发酵温度30℃-37℃，ph为7-8，发酵时间为4-6天。作为本发明的某些实施方式，所述发酵温度为30℃。作为本发明的某些实施方式，所述发酵的ph为7.5。作为本发明的某些实施方式，所述发酵时间为5天。

9、具体的应用和条件可以根据实际要求进行调整生产菌的发酵接种量，种子液浓度。作为本发明的某些实施方式，9α-oh-ba生产菌种子液的od600为8-12，种子液体积为发酵培养液的10％-20％。作为本发明的某些实施方式，9α-oh-ba生产菌种子液的od600为10。

10、如上所述，本发明的一种用于生产制备9α-oh-ba的基因工程菌株、及其制备方法和应用，具有以下有益效果：

11、1、本发明提供的基因工程菌株能够稳定积累9α-oh-ba产物；

12、2、本发明提供的基因工程菌株同时降低了副产物的积累量，提高了9α-oh-ba的产物纯度和产量；

13、3、实现了从植物甾醇出发，通过生物转化直接得到9α-oh-ba，mfδkstdδhsd4aδfada5从10g/l植物甾醇积累了5.88g/l 9α-oh-ba。

技术特征：

1.一种用于生产制备9α-oh-ba的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌是使9α-oh-ba生产菌株的出发菌株中的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和硫酯酶fada5的编码基因失活。其中，所述9α-oh-ba生产菌株的出发菌株为放线菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和硫酯酶fada5的编码基因失活；

3.如权利要求1～2任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中原来17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和硫酯酶fada5分别具有如下序列seq id no:1-seqid no:2。

4.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌发酵生产9α-oh-ba中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵生产的发酵培养基含有玉米浆干粉10-20g/l，葡萄糖8-15g/l，磷酸氢二铵0.5-1g/l，硝酸钠5-8g/l，吐温80 1-3g/l，按1:3质量比混合的植物甾醇与羟丙基-β-环糊精10～30g/l，ph为7-8；

6.权利要求4～5任一项所述的应用，其特征在于，所述发酵生产的条件为发酵温度30℃-37℃，ph为7-8，发酵时间为4-6天；

技术总结
发明提供一种用于生产制备9α‑OH‑BA的基因工程菌株，是将出发菌株中的17‑羟基甾体/22‑OH‑BNC‑CoA脱氢酶Hsd4A和硫酯酶FadA5的编码基因失活。本发明还提供了该基因工程菌株的制备方法和应用，本发明的用于生产制备9α‑OH‑BA的基因工程菌株稳定积累9α‑OH‑BA产物，降低了副产物的含量，提高了终产物中9α‑OH‑BA的纯度和产量，纯度可达95％以上，产量可达5.88g/L，为9α‑OH‑BA的工业化大规模生产提供了良好的技术支持。

技术研发人员：张保国,韩苏皖,刘铁汉
受保护的技术使用者：北京集智合成生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1