一种普卡那肽的纯化方法与流程

本发明涉及普卡那肽纯化的，尤其是指一种普卡那肽的纯化方法。

背景技术：

1、慢性特发性便秘(chronic idiopathic constipation，cic)属于下消化道动力学障碍性疾病，其发病与结肠、肛门直肠动力学及精神心理异常有关,也是困扰中、老年人群的常见多发病,不同程度影响现代人的工作和生活质量。流行病学调查结果显示,世界各国和地区因饮食结构和生活习惯各异,cic的发病率有较大差异。据不完全统计,欧美等发达国家为2.0％～28.0％；中国南北方地区为9.0％～20.3％。

2、普卡那肽(plecanatide)由美国synergy制药公司研发,是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物，具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人慢性特发性便秘。

3、普卡那肽是含有双二硫键连接的16个氨基酸的环状多肽，它是鸟苷酸环化酶-c肽的激动剂，结构式如下：

4、

5、普卡那肽制备通常使用两步法，即为两组cys采用不同保护基，有选择的分步完成两个二硫键s-s的构建，通过纯化冻干得到普卡那肽。该方法肽序合成过程困难，过程易产生大量的杂质，影响纯化效果。

6、而且该样品稳定性较差，环化及纯化过程易产生一杂质，保留时间在普卡那肽之后，分子量与普卡那肽相同，推测为空间异构杂质，该杂质纯化分离难度较大。例如专利cn144315973a中公开了一种普卡那肽的纯化方法，通过两步纯化法，一步纯化以50mmol醋酸铵，氨水调ph 8.3为流动相，获得纯度88.63％的一纯溶液，二步纯化以乙酸水溶液为流动相，可获得纯度98.69％，最大单杂0.94％的普卡那肽。该专利方法未能有效分离异构体杂质，使用酸性流动相(2％乙酸水溶液，ph约3)进行二纯，异构体杂质稳定性较差，且纯化过程未采取方法对该杂质进行控制，最终产品异构体杂质为0.94％，影响产品质量。因此急需寻找一种更高效的纯化方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种普卡那肽的纯化方法。本发明所述纯化方法简单、可操作性强，有利于进行规模化生产。

2、本发明的目的在于提供一种普卡那肽的纯化方法，包括以下步骤：

3、提供普卡那肽环化溶液，并过滤得到粗品溶液；

4、取粗品溶液，使用c18反相色谱柱，利用第一流动相进行第一次梯度洗脱，收集洗脱峰得到一纯溶液，将一纯溶液使用碱性调节剂调ph至6.5-7.0；所述第一流动相包括流动相a1和流动相b1；

5、取一纯溶液，使用c18反相色谱柱，利用第二流动相进行第二次梯度洗脱，收集洗脱峰得到二纯溶液；所述第二流动相包括流动相a2和流动相b2；

6、将二纯溶液进行脱盐，得到普卡那肽的脱盐溶液，将所述脱盐溶液进行浓缩、干燥，得到普卡那肽成品。

7、在本发明的一个实施例中，所述过滤采用微孔滤膜进行，规格为0.45um或0.22um。

8、在本发明的一个实施例中，所述c18反相色谱柱的参数：色谱柱中填料的粒径10um，孔径柱尺寸为20×250mm。

9、在本发明的一个实施例中，所述流动相a1为tfa水溶液，流动相b1为乙腈。

10、在本发明的一个实施例中，将一纯溶液使用碱性调节剂调ph至6.5-7.0中，一纯溶液为酸性(ph2.0左右)，根据稳定性考察情况，酸性条件有利于构型a(普卡那肽)转化至构型b(杂质)，中性条件a(普卡那肽)构型则较稳定。因此优选ph至中性，例如可以为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0等，或者任意两个数值中的任意值。

11、在本发明的一个实施例中，所述tfa水溶液的体积浓度为0.05％～0.1％。

12、在本发明的一个实施例中，所述碱性调节剂选自氨水。

13、在本发明的一个实施例中，所述流动相a2为磷酸二氢铵水溶液，流动相b2为乙腈。

14、在本发明的一个实施例中，所述磷酸二氢铵水溶液的浓度为30mmol/l～50mmol/l，进一步地，优选50mmol/l，使用氨水调节至ph为6.5～7.0，进一步地，优选7.0。

15、在本发明的一个实施例中，所述第一次梯度洗脱的程序如下所示：

16、

17、在本发明的一个实施例中，所述第二次梯度洗脱的程序如下所示：

18、

19、在本发明的一个实施例中，所述脱盐采用hplc法进行，所述脱盐的hplc的洗脱的程序如下所示：

20、

21、在本发明的一个实施例中，浓缩采用本领域常规的方式，优选减压浓缩方式，其中，水浴温度为30℃-33℃，真空值为0-10mbar。

22、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

23、现有技术中普卡那肽纯化分离得到的普卡那肽纯度低，异构体杂质较大，难以控制，而本发明纯化过程简单、易于操作，可以有效控制纯化过程中普卡那肽的稳定性，且得到的最终产品纯度高于99％，单杂0.3％左右的样品。

24、本发明中通过一纯操作，可去除大部分与主成分差异较大，保留时间相差较远的杂质，降低后续纯化难度；一纯后使用稀氨水等碱性调节剂将ph调至6.5-7.0，提高样品的稳定性，减缓空间异构杂质增加的速率。

25、本发明通过二纯以50mmol磷酸二氢铵(用稀氨水调ph7.0)为流动相，杂质分离效果好，可得到纯度高于99％，单杂0.3％左右样品，收率较高，且在该条件下洗脱过程样品溶液ph为7.0左右，不需进行ph调节，稳定性较好，有利于进行规模化生产。

技术特征：

1.一种普卡那肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述过滤采用微孔滤膜进行，规格为0.45um或0.22um。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述c18反相色谱柱的参数：色谱柱中填料的粒径10um，孔径柱尺寸为20×250mm；检测波长：λ＝210-230nm；流速：12ml/min。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相a1为tfa水溶液，流动相b1为乙腈；所述tfa水溶液的体积浓度为0.05％～0.1％。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述碱性调节剂选自氨水。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相a2为磷酸二氢铵水溶液，流动相b2为乙腈。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述磷酸二氢铵水溶液的浓度为30mmol/l～50mml/l，ph为6.5～7.0。

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述第一次梯度洗脱的程序如下所示：

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述第二次梯度洗脱的程序如下所示：

10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述脱盐采用hplc法进行，所述脱盐的hplc法的洗脱的程序如下所示：

技术总结
本发明涉及一种普卡那肽的纯化方法。本发明的纯化方法：提供普卡那肽环化溶液，并过滤得到粗品溶液；取粗品溶液，使用C18反相色谱柱，利用第一流动相进行第一次梯度洗脱，收集洗脱峰得到一纯溶液，将一纯溶液使用碱性调节剂调pH至6.5‑7.0；所述第一流动相包括流动相A1和流动相B1；取一纯溶液，使用C18反相色谱柱，利用第二流动相进行第二次梯度洗脱，收集洗脱峰得到二纯溶液；所述第二流动相包括流动相A2和流动相B2；将二纯溶液进行脱盐，收集洗脱峰，得到普卡那肽的脱盐溶液，将所述脱盐溶液进行浓缩、干燥，得到普卡那肽成品。本发明纯化过程简单、可有效提高普卡那肽的纯度。本发明所述纯化方法简单、可操作性强，有利于进行规模化生产。

技术研发人员：郭晨晨,王赍鸿,薛咏琰,高靥
受保护的技术使用者：苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22