百日咳杆菌核酸的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种百日咳杆菌核酸的特异性检测用引物探针组合和试剂盒。

背景技术：

1、百日咳一般由百日咳鲍特杆菌(简称百日咳杆菌)感染所引起，主要经飞沫传播，易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周。发病早期(卡他期)仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大。1～2周后出现阵发性痉挛性咳嗽(痉挛期)，这时细菌释放毒素，导致粘膜上皮细胞纤毛运动失调，大量粘稠分泌物不能排出，刺激粘膜中的感受器产生强烈痉咳，呈现出特殊的高音调鸡鸣样吼声。形成的粘液栓子还能堵塞小支气管导致肺不张和呼吸困难、紫绀。此外可伴有呕吐、惊厥。4～6周后逐渐转入恢复期，阵咳减轻，趋向痊愈，但有1～10％病人易继发溶血性链球菌、流感杆菌等的感染。本病病程较长，故名百日咳。在致病过程中，百日咳杆菌始终在纤毛上皮细胞表面，并不入血。

2、目前临床上用于百日咳杆菌检测最常用的方法有细菌培养法、血清学检测、分子生物学检测等。病原学诊断的标准是根据在卡他期和痉咳初期获得的鼻咽部样本中找到百日咳杆菌。该方法虽然特异性较好，但敏感性较低，操作技术要求高，且需培养3～7d才能出结果。虽然免疫学检测特异性高，但是其结果的准确性受病程、患者年龄及是否接种疫苗影响。以pcr为基础的分子诊断方法对临床上难于分离培养的病原菌可进行快速、准确的鉴定，对疾病的早期诊断及合理用药具有很大的辅助作用。核酸扩增技术应用于百日咳诊断以来，在对百日咳鲍特菌的早期诊断方而显示出巨大的优势，值得临床推广。但使用荧光pcr检测临床样本时，往往会面临如下问题：

3、1)使用百日咳特异性基因，如pt、prn基因等设计引物探针，可以特异性地检测百日咳杆菌，但由于上述基因在百日咳杆菌中以单拷贝存在，敏感性较差；

4、2)使用is481设计引物探针，可以避免与绝大多数细菌的交叉，且该基因在百日咳杆菌中有100～200个拷贝，敏感性极高。但is481在霍氏鲍特杆菌、支气管鲍特杆菌和副百日咳鲍特杆菌也有低拷贝的存在，可能引起交叉反应；

5、3)对于不同来源的百日咳杆菌，引物/探针的覆盖度不够，可能导致包容性不佳，容易发生漏检；

6、4)呼吸道中有大量的定植菌和其它病原体，引物/探针的特异性不好，容易有交叉反应，得到假阳性结果；

7、5)百日咳杆菌的检测，一般使用咽拭子，样本中的干扰物质可能抑制pcr反应，导致假阴性的结果。

技术实现思路

1、本发明提供一种百日咳杆菌核酸的特异性检测用引物探针组合和试剂盒，目的是解决背景技术中存在的至少一个上述问题。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、一种用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的引物探针组合，所述引物探针组合包括上游引物、下游引物以及探针，所述上游引物的序列为：5’-gaccttcctacgtcga-3’；

4、所述下游引物的序列为：5’-ttgcggcgcagctcca-3’；

5、所述探针的序列为：5’-atgcgtcctcgc-3’。

6、进一步地，所述探针的5’末端有荧光基团，所述荧光基团包括fam、vic、rox和/或cy5，所述探针的3’末端有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括tamra、bhq和/或mgb。

7、同时，本发明提供一种用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒，包括pcr反应液、酶混合液，所述pcr反应液中包括上述的上游引物、下游引物以及探针。

8、进一步地，所述用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒的pcr反应体系包括：2×pcr缓冲液10μl、100μg/ml的所述上游引物0.1μl、100μg/ml的所述下游引物0.1μl、100μg/ml的所述探针0.03μl、样品dna 5μl，加灭菌水至终体系15μl。

9、进一步地，所述用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒的pcr反应循环参数为：

10、97℃，2min；进入循环阶段：97℃变性10s，60℃退火延伸30s，共反应40个循环。

11、进一步地，所述用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒的百日咳杆菌最低检测限为25cfu/ml。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

13、本发明提供了一种用于特异性检测样品中中百日咳杆菌核酸的引物探针组合，针对百日咳杆菌与霍氏鲍特杆菌、支气管鲍特杆菌和副百日咳鲍特杆菌中is481序列不一致的区域设计引物探针，兼顾了灵敏度和特异性。使用本发明的引物探针制备成pcr检测试剂，不仅有很高的灵敏度，而且有很好的包容性和特异性，且各靶标间没有相互干扰，也不受常见的干扰物质的影响，适合对临床样本中百日咳杆菌的检测。

技术特征：

1.一种用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的引物探针组合，所述引物探针组合包括上游引物、下游引物以及探针，其特征在于，所述上游引物的序列为：5’-gaccttcctacgtcga-3’；

2.根据权利要求1所述的用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’末端有荧光基团，所述荧光基团包括fam、vic、rox和/或cy5，所述探针的3’末端有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括tamra、bhq和/或mgb。

3.一种用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，包括pcr反应液、酶混合液，所述pcr反应液中包括如权利要求1-2任一项所述的上游引物、下游引物以及探针。

4.根据权利要求3所述的用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒的pcr反应体系包括：2×pcr缓冲液10μl、100μg/ml的所述上游引物0.1μl、100μg/ml的所述下游引物0.1μl、100μg/ml的所述探针0.03μl、样品dna 5μl，加灭菌水至终体系15μl。

5.根据权利要求4所述的用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒的pcr反应循环参数为：

6.根据权利要求4或5所述的用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测样品中百日咳杆菌核酸的试剂盒的百日咳杆菌最低检测限为25cfu/ml。

技术总结
本发明公开了一种百日咳杆菌核酸的特异性检测用引物探针组合和试剂盒，该引物探针组合包括上游引物、下游引物以及探针，上游引物的序列为：5’‑GACCTTCCTACGTCGA‑3’；下游引物的序列为：5’‑TTGCGGCGCAGCTCCA‑3’；探针的序列为：5’‑ATGCGTCCTCGC‑3’。该试剂盒包括PCR反应液、酶混合液，PCR反应液中包括上述的上游引物、下游引物以及探针，采用该试剂盒进行检测，不仅有很高的灵敏度，而且有很好的包容性和特异性，且各靶标间没有相互干扰，也不受常见的干扰物质的影响，适合对临床样本中百日咳杆菌的检测。

技术研发人员：吕静,何飞,杨红梅,蔡璇,李国明,夏险,王雷,胡兵,王艳萍,郑向梅,聂丹文,田炳秋,李静,董石磊,专行
受保护的技术使用者：湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5