过表达EGF的慢病毒载体、重组干细胞及其应用

本公开属于生物，具体涉及一种过表达egf的慢病毒载体及含有该慢病毒载体的重组干细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、表皮生长因子(egf)在众多类型细胞(特别是成纤维细胞和角质形成细胞)的生长、增殖和分化中发挥着重要作用，是一种重要的表皮生长因子，能够刺激表皮细胞增殖，可应用于伤口愈合的研究。表皮生长因子最早从雄性小鼠的颌下线中分离出来，广泛存在于人体不同组织、体液中，可以刺激多种细胞增殖和迁移，用于角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合，可预防疤痕增生。目前，egf在我国作为医用外用制剂使用，作为有效成分，能够使创面修复，保障表皮的修复，适用于皮肤烧烫伤创面(浅ⅱ度至深ⅱ度烧烫伤创面)、残余创面、供皮区创面及慢性溃疡创面等的治疗。

2、间充质干细胞(mscs)是一类具有多谱系分化潜能的间质细胞。其来源广泛、免疫原性低、可为组织再生创造良好的微环境，是一种适合免疫调节和再生修复的细胞类型。已有研究阐明，转egf基因的间充质干细胞(egf-msc)有助于创面愈合。cn113088496a公开了一种egf间充质干细胞外泌体，其利用慢病毒载体感染间充质干细胞，但编辑后egf表达水平略有升高，编辑后细胞上清表达水平不到20pg/ml，egf浓度仍然很低，仅为pg/ml的数量级。因此需要开发一种能够提高egf蛋白表达量和分泌量的方法。

技术实现思路

1、为了解决间充质干细胞中egf蛋白表达水平和分泌水平低的问题，本公开提供了一种能够过表达egf的慢病毒载体及包含该慢病毒载体的间充质干细胞，其能够用于治疗创面修复和愈合、组织修复、伤口愈合或预防疤痕增生等。

2、为了实现本公开的目的，在第一方面，本公开提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’ltr、3’ltr、在5’ltr和3’ltr之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为egf的编码核苷酸序列。

3、在一些实施方式中，所述egf的编码核苷酸序列为seq id no:1所示的核苷酸序列或与其具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

4、在一些实施方式中，所述3’ltr和5’ltr包括一个或多个修饰。

5、在一些实施方式中，所述5’ltr和3’ltr的u3可以被缺失或突变。

6、在一些实施方式中，所述3’ltr是缺失了u3区域的3’ltr(3’ltr-δu3)。

7、在一些实施方式中，所述5’ltr是缺失了u3区域的5’ltr(5’ltr-δu3)。

8、在一些实施方式中，所述5’ltr的启动子选自巨细胞病毒cmv启动子、劳斯肉瘤病毒rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子，优选选自劳斯肉瘤病毒rsv启动子。

9、在一些实施方式中，与egf的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1a(ef1α)启动子或其转录活性片段，rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子，优选选自短延伸因子1a(ef1α)启动子。

10、在一些实施方式中，egf的编码核苷酸可操作连接有ef1α启动子和kozak翻译起始序列。

11、在一些实施方式中，所述载体质粒还包括筛选标记物的编码核苷酸。

12、在一些实施方式中，所述筛选标记物选自荧光素酶(luciferase)、荧光蛋白、链霉亲和素结合肽、嘌呤霉素抗性标记物、氨苄抗性标记物、卡那霉素抗性标记物和新霉素抗性标记物中的一种或多种。优选地，所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白(egfp)。

13、在一些实施方式中，所述载体质粒还包括sv40早期pa。

14、在一些实施方式中，所述载体质粒的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。

15、在一些实施方式中，所述载体质粒包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节rna转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地，所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(hiv)rev应答元件(rre)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)。

16、在一些实施方式中，所述载体质粒还包括中央多聚嘌呤区(cppt)或中心终止序列(cts)。

17、优选地，所述cppt序列为hiv1的cppt。

18、优选地，所述cts序列为hiv1的cts。

19、在一些实施方式中，所述载体质粒从5’ltr区到3’ltr区依次包含：rsv启动子，5’ltr-δu3，ψ序列，rre，cppt，ef1α启动子，kozak翻译起始序列，egf的编码核苷酸，egfp，wrpe，3’ltr-δu3和sv40早期pa。

20、本公开构建的携带egf编码核苷酸的慢病毒载体优选可在干细胞内高表达的启动子和翻译起始序列，并且由于慢病毒载量有限，上述元件加上egf大序列基本满载，发明人大胆舍弃了抗生素筛选序列，只保留egfp作为观察和鉴定过表达效率的标签。另外，考虑到egf基因序列已经很大，egf基因前不再增加额外的信号肽序列，其后不再增加连接区和跨膜区序列，此设计可以提高慢病毒载体的感染效率，并进一步提高感染的重组干细胞的egf的表达率和表达的精确度，更进一步提高蛋白分泌水平。

21、在第二方面，本公开提供了一种重组干细胞，所述重组干细胞包含第一方面所述的慢病毒载体，能够表达第一方面所述慢病毒载体中携带的目的核苷酸。

22、在一些实施方式中，所述重组干细胞为间充质干细胞。

23、在一些实施方式中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

24、转染有携带egf编码核苷酸的所述慢病毒载体的重组干细胞特别是间充质干细胞可以过表达egf基因。所述间充质干细胞是具有高表达egf能力的间充质干细胞。

25、在第三方面，本公开提供了第二方面的重组干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：

26、(1)构建第一方面的慢病毒载体；

27、(2)用步骤(1)构建的慢病毒载体转染干细胞获得第二方面的重组干细胞；以及

28、(3)培养步骤(2)所获得的重组干细胞。

29、在一些实施方式中，所述细胞为干细胞。

30、在一些实施方式中，所述干细胞为间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

31、在一些实施方式中，所述干细胞为转染有携带egf编码核苷酸的所述慢病毒载体的人脐带间充质干细胞。

32、在一些实施方式中，步骤(2)中，干细胞的接种密度为1.0×105-2.0×105，优选为1.0×105。

33、在一些实施方式中，步骤(2)中，病毒转染复数moi为10-30，优选为20-30。

34、在一些实施方式中，步骤(2)中，转染采用的辅助转染试剂选自聚凝胺(polybrene)。优选地，polybrene的工作浓度为5-8μg/ml。

35、根据本公开的制备方法通过慢病毒的手段，过表达egf基因，显著提高了重组干细胞表达和分泌egf的水平。

36、在第四方面，本公开提供了一种药物组合物，所述组合物包含第一方面的慢病毒载体，第二方面的重组干细胞或第三方面的制备方法获得的重组干细胞，以及药学上可接受的赋形剂或载体。

37、在第五方面，本公开提供了第一方面的慢病毒载体、第二方面的重组干细胞、第三方面的制备方法获得的重组干细胞或第四方面的药物组合物在制备治疗创面修复和愈合、组织修复、伤口愈合或预防疤痕增生的药物中的应用。

38、在一些实施方式中，所述创面包括但不限于角膜损伤、烧烫伤、手术或慢性溃疡引起的创面等。

39、相比于现有技术，本公开具有如下的有益效果：

40、1、本公开涉及的过表达egf慢病毒载体设计简洁高效，感染效率高。

41、2、本公开涉及的过表达egf慢病毒感染的间充质干细胞的egf在mrna水平上有所提升，能够显著性地增加egf的表达量；

42、3、本公开涉及的过表达egf慢病毒感染的间充质干细胞上清中egf蛋白分泌水平显著升高。