一种检测塞内卡病毒的荧光微球免疫层析快速检测试纸条及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种检测塞内卡病毒的荧光微球免疫层析快速检测试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

1、小rna病毒科是一类具有对称二十面体蛋白衣壳，大小约为30nm的无囊膜的单股正链rna病毒。小rna病毒科成员众多，目前包括了35个属，口蹄疫病毒属、塞内卡病毒属、肝病毒属、心病毒属以及肠道病毒属等均属于小rna病毒科。在过去10年中，新发现的小rna病毒数量急剧增加，导致其种类繁多，且多数小rna病毒感染宿主后临床无症状，因此给人类和动物的健康带来了巨大的威胁。宿主感染小rna病毒后，不但会影响神经系统、消化系统和呼吸系统，也会导致心脏、肝脏以及皮肤等器官的损伤。

2、塞内卡病毒(seneca valley virus，svv)是小rna病毒科塞内卡病毒属的唯一成员，其基因组大小约为7.2kb，被四个结构蛋白(vp1、vp2、vp3和vp4)和七个非结构蛋白构成的二十面体蛋白衣壳所包裹。其中vp2是刺激机体产生中和抗体的最佳蛋白，也是抗原表位最富集的区域，因此vp2常作为svv诊断的主要靶抗原。猪作为svv的天然宿主，感染后口鼻部、蹄部会出现水泡或是溃疡性病变，有10％～90％的病猪通常会表现出厌食、嗜睡、高热和跛行的症状，少数病猪伴有腹泻。该病对新生仔猪的危害极大，有研究报道表明感染svv会导致新生仔猪的急性死亡，其病死率可达30％～70％。自2002年，首次在per.c6细胞系培养污染物中发现svv以来，svv快速的在全世界范围内传播。2007年，加拿大在猪的特发性水泡病中检测到了svv。2010年，由svv导致的水泡病病例首次在美国报道。2014年，svv在巴西大规模爆发，随后在美国、加拿大、哥伦比亚、泰国、中国和越南先后爆发了该疫情。svv感染病例严重威胁我国养猪业的发展。

3、目前我国猪水疱性疫病病原主要为fmdv和svv，对家畜的感染给养殖业造成了巨大的经济损失。由于svv导致的水泡病临床症状与fmdv感染症状十分相似，很难从临床症状上进行区分。而两种不同病原感染的临床防控措施完全不同，为了快速、特异性诊断出究竟是svv还是fmdv感染对于临床疾病的快速防控十分必要。因而，急需研制一种快速、特异性强的诊断方法，对临床样品进行svv的检测和诊断。

4、荧光微球是一种载有荧光分子的功能性微球，因其具有发光、结构稳定、易修饰等特点被广泛应用在免疫层析检测中，荧光微球免疫层析法，是以荧光微球作为标记物而建立的一种免疫层析技术，具有快速、简单、成本低且不需要专业操作人员的特点，近年来在临床诊断中被广泛应用，同时可利用荧光定量的特性，实现定性和定量的快速检测，与胶体金免疫层析相比具有更高的灵敏度。目前，采用荧光微球免疫层析方法检测塞内卡病毒的方法较为缺乏。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种杂交瘤细胞株5g6(hybridoma cell line 5g6)，能够分析产生的抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6，所述抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6可应用于塞内卡病毒的荧光免疫层析检测方法中，具有较高的灵敏性和特异性。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种杂交瘤细胞株5g6(hybridoma cell line 5g6)，所述杂交瘤细胞株5g6的保藏编号为cctcc no：c2023188。

4、本发明提供了上述技术方案所述杂交瘤细胞株5g6分泌产生的抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6。

5、本发明提供了上述技术方案所述杂交瘤细胞株5g6或上述技术方案所述抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6在塞内卡病毒检测中的应用。

6、本发明提供了一种用于检测塞内卡病毒的产品，所述产品包括上述技术方案所述抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6；所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒。

7、本发明提供了一种检测塞内卡病毒的荧光微球免疫层析快速检测试纸条，包括：样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和pvc底板；

8、所述结合垫上喷涂有荧光微球标记的单克隆抗体溶液；

9、所述荧光微球标记的单克隆抗体溶液包括荧光微球标记的第一抗塞内卡病毒单克隆抗体；所述第一抗塞内卡病毒单克隆抗体包括上述技术方案所述的抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6；

10、所述硝酸纤维素膜上依次平行设置一条检测线和一条质控线；所述检测线包被第二抗塞内卡病毒单克隆抗体；

11、所述质控线包被兔抗鼠igg。

12、优选的，所述第二抗塞内卡病毒单克隆抗体包括抗塞内卡病毒单克隆抗体6d7；所述抗塞内卡病毒单克隆抗体6d7由杂交瘤细胞株6d7分泌产生。

13、本发明提供了上述技术方案所述试纸条的制备方法，包括以下步骤：

14、将荧光微球标记的第一抗塞内卡病毒单克隆抗体喷涂到结合垫上，得到荧光微球结合垫；

15、将第二抗塞内卡病毒单克隆抗体用包被液稀释后喷涂于硝酸纤维膜上作为检测线；

16、将兔抗鼠igg喷涂于硝酸纤维膜上作为质控线；

17、将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水纸按顺序粘贴到pvc底板。

18、优选的，制备荧光微球结合垫时：

19、荧光微球标记的第一抗塞内卡病毒单克隆抗体喷涂时的喷量为10～15μl/cm；

20、制备硝酸纤维素膜时：

21、第二抗塞内卡病毒单克隆抗体喷涂时的浓度为0.4～0.8mg/ml，喷量为0.8～1.2μl/cm；

22、兔抗鼠igg浓度为0.2～0.5mg/ml，喷量为0.8～1.2μl/cm；

23、检测线和质控线之间的间隔为4～6mm。

24、优选的，结合垫喷涂荧光微球标记的单克隆抗体溶液之前采用结合垫处理液进行浸湿；所述结合垫处理液包括：0.01～0.02mol/l ph 7.4pbs缓冲液、1％～5％(w/v)蔗糖、1％～3％(w/v)bsa和1％～5％(w/v)tween-20；

25、所述包被液包括：0.01～0.02mol/lph 7.4pbs缓冲液、0.5％～2％(w/v)d-海藻糖和0.5％～2％(w/v)bsa。

26、本发明提供了上述技术方案所述试纸条或上述技术方案所述制备方法制备得到的试纸条在制备临床检测塞内卡病毒产品中的应用。

27、本发明的有益效果：

28、本发明提供了一种杂交瘤细胞株5g6(hybridoma cell line 5g6)，所述杂交瘤细胞株5g6的保藏编号为cctcc no：c2023188。本发明提供的杂交瘤细胞株5g6可以分泌产生抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6。所述抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6可应用于塞内卡病毒的荧光免疫层析方法检测中，且采用荧光免疫层析方法抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6检测时，对塞内卡病毒检测的灵敏性和特异性较高，重复性较好。

29、进一步地，采用该抗塞内卡病毒单克隆抗体5g6，结合抗塞内卡病毒单克隆抗体6d7可制备得到检测塞内卡病毒的荧光微球免疫层析快速检测试纸条，所述试纸条具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、操作简单等特点。所述试纸条可与紫外线手电筒配合使用，可广泛应用于养殖场中，实现塞内卡病毒的快速定性检测；另一方面，所述试纸条可结合荧光免疫分析仪使用，实现对样品中塞内卡病毒的定量分析检测，从而在养猪业中降低塞内卡病毒检测的成本和时间，为塞内卡病毒的防治提供快速诊断的检测方法。

30、生物保藏说明

31、本发明提供的杂交瘤细胞株5g6(hybridoma cell line 5g6)已于2023年7月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctccno：c2023188，细胞株编号为5g6。