同时测量游离DNA多种组学的测序方法和诊断技术与流程

本发明涉及同时测量游离dna多种表观遗传组学的测序方法和诊断技术。

背景技术：

1、游离dna的来源是体内的死亡细胞(凋亡、坏死等)，携带有来源细胞自身的生理状态信息，给予本领域技术人员在不进行手术取样的前提下对肿瘤组织、胎儿、病变组织、移植器官等一窥究竟的机会。细胞生理状态的改变直接影响了多种表观遗传信息，体现在多种功能基因组学指标的改变上，可以被游离dna携带至血液中。利用外周血游离dna测序进行疾病筛查和诊断，是未来最有前景的无创诊断和筛查技术路线之一。

2、目前，在获得游离dna样品后，本领域技术人员仅能够将样品分为多份，对每份样品的一种组学特征(如dna的甲基化组学或dna的片段组学)进行检测，也即对于每条游离dna仅能够获得其一种组学特征，无法同时获得每条游离dna的多组学特征(如同时获得每条游离dna的甲基化组学特征，该条游离dna的片段组学特征和该条游离dna与特定蛋白结合关系的特征)。这导致对游离dna的测序和分析仅能够分别从单组学的角度进行，无法获得同一条游离dna的各组学之间的关联信息，也无法同时判断每条dna的所有组学特征，从而难以确定该条dna是否来自异常细胞，这显著影响下游应用(例如肿瘤筛查，孕期筛查，器官移植评估等)的灵敏度和准确性。

3、本领域对高灵敏度和高准确性的游离dna的检测和分析方法始终存在需要。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种确定受试者的游离dna的多组学特征的方法，其综合分析每条游离dna的多组学信息，能够以高灵敏度和高准确度进行疾病诊断，孕期筛查和器官移植评估。该方法采用多指标联合检测、多维度信息综合可以显著提高信噪比。

2、在一方面，本发明提供了一种分析受试者的游离dna的方法，其包含以下步骤：

3、(1)获得包含所述受试者的游离dna的样品；

4、(2)富集所述样品中与目标蛋白结合的游离dna或富集所述样品中不与目标蛋白结合的游离dna，由此获得富集的游离dna；

5、(3)对富集的游离dna进行测序，获得所述富集的游离dna中每条dna的甲基化组学数据，该条dna的片段组学数据以及该条dna与目标蛋白的结合关系数据；以及

6、(4)分析(3)中所述的结合关系数据和所述的甲基化组学数据；分析(3)中所述的结合关系数据和所述的片段组学数据；或者分析(3)中所述的结合关系数据、所述的甲基化组学数据和所述的片段组学数据。

7、本发明的分析方法通过获得同一条游离dna的多组学特征进行分析，其具有显著提升的灵敏度或准确度。

8、在另一方面，本发明的分析受试者的游离dna的方法以及用于本发明的方法的试剂在以下的一种或多种方面的用途：

9、a.受试者疾病的诊断，如早期诊断或筛查；

10、b.孕期筛查，器官移植评估；

11、c.对疾病治疗方案的评价；

12、d.对疾病进展情况的监测；

13、e.对某些疾病的高风险人群进行监测；和/或

14、f.流行病学的监测。

15、本发明方法的主要优势至少包括：

16、(1)通过获得包含与特定目标蛋白结合的游离dna的样品，可以获得异常游离dna来源占比高的数据，大大提高检测灵敏度和特异性；

17、(2)本发明的方法可以同时获得同一条dna的多组学特征；

18、(2)将测序聚焦在特定的游离dna中，减少测序量和样品量，降低成本；

19、(3)可以获得高深度的数据，从而提升组学测序的效果；

20、(4)同时检测多组学并获得多组学特征，维度交叉可大幅提高所获得信息的特异性和准确度；

21、(5)每一种组学都受益于样品中的异常游离dna来源的高占比，使得结果的信噪比更高，数据更可靠；

22、(6)方法简便易操作，总体成本相对较低；

23、(7)仅需少量样品，在实际应用中可以与其他传统检测项目同时进行。

24、本发明的方法可应用于多个维度交叉的检测，能够用于疾病靶点的发现，可用于癌症等疾病的无创筛查和诊断，可用于孕期筛查，器官移植评估，也可以作为工具服务于科学技术的研究。

1.一种分析受试者的游离dna的方法，其包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白选自组蛋白、转录因子、核酸酶蛋白、crispr相关蛋白、抗体和药物蛋白，优选地目标蛋白是组蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组蛋白是修饰的组蛋白，所述修饰的组蛋白选自以下一种或多种：组蛋白的乙酰化、组蛋白的甲基化、组蛋白的磷酸化和组蛋白的泛素化；

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述步骤(2)还包括：使用免疫沉淀的方法获得核小体，并从所述核小体中获得所述富集的游离dna。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫沉淀的方式包括使用靶向组蛋白的抗体偶联磁珠。

6.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中步骤(3)还包括碱基转化步骤，所述转化步骤为将所述富集的游离dna中的无修饰胞嘧啶碱基以及甲基化或羟甲基化的胞嘧啶碱基分别转化，从而被测序仪识别为两种不同的碱基。

7.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述步骤(3)还包括：对所述富集的游离dna建立测序文库，并对测序文库进行测序。

8.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中步骤(3)中所述的测序是dna甲基化敏感测序；优选地，步骤(3)中所述的测序是第三代测序。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述建立测序文库包括缺刻修复、末端修复、双链或单链接头连接的步骤。

10.根据权利要求1至9所述的方法，其在以下的一种或多种方面的用途：

11.用于权利要求1至9所述的方法的试剂在制备用于以下用途的诊断剂或监测剂中的用途：

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述试剂包括富集权利要求1至9任一项所述游离dna的试剂、及用于检测权利要求1至9任一项所述的dna的甲基化的试剂和检测权利要求1至9任一项所述的dna的片段组学的试剂。

13.根据权利要求10-12任一项所述的用途，其中所述疾病选自癌症、传染性疾病、神经变性疾病、心血管疾病、肝脏疾病、炎症、自身免疫疾病、和糖尿病；

14.根据权利要求1至9任一项所述的方法或权利要求10-13任一项所述的用途，其中所述样品来自所述受试者，