抗H7亚型禽流感纳米抗体D67及其应用

本发明属于抗体，具体涉及抗h7亚型禽流感纳米抗体d67及其应用。

背景技术：

1、禽流感是一种由a型流感病毒(avian influenza virus,aiv)引发的禽类急性、烈性传染病，是在家禽、鸟类中常见的一种流行性感冒。禽流感病毒属于正黏病毒科、a型流感病毒属，是一种单股负链rna病毒。根据表面血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的差异，禽流感病毒可分为18个h亚型(h1-h18)和11个n亚型(n1-n11)。依据病毒致病性差异，禽流感可被分为高致病性、低致病性及非致病性三类。在家禽中流行较广泛的为h5、h6、h7、h9四种亚型病毒，其中h5和h7亚型流感病毒引起禽类较高的发病率和死亡率，属于高致病性禽流感病毒，又称为hpai病毒。禽流感病毒通过表面ha与宿主细胞唾液酸(sa)受体特异性结合而感染宿主，而禽类和人类分别以表达sa-2、3-gal受体和saα-2、6-gal受体为主。

2、血凝素(ha)又称红血球凝集素，细胞内质网上形成的蛋白前体ha0是血凝素形成的先决条件，ha0随后裂解为ha1和ha2，使病毒产生感染性。根据x射线晶体衍射技术显示，血凝素是由3个ha蛋白构成的三聚体，其结构可分为纤细杆状基底和球状头部两部分，基底部分由ha蛋白组成，而头部则主要为ha1的肽链。血凝素在病毒入侵宿主细胞的过程中具有关键作用，尽管不同亚型病毒中，ha0蛋白的裂解位点存在差异，但位于ha蛋白头部的唾液酸受体结合位点却高度保守。在侵染过程中，病毒ha蛋白与宿主表面的特异受体结合，促进病毒与宿主细胞膜融合的发生，介导病毒遗传物质进入宿主细胞诱发感染。

3、随着禽流感病毒不断升级，禽流感的易感率和致死率不断变化，传统抗体逐渐显露出不足。1993年科学家在骆驼体内发现了纳米抗体，其轻链天然缺失，只包含一个vhh和两个常规的重链恒定(ch2与ch3区)，纳米抗体通过重链可变区的结构变化与抗原结合，可弥补传统抗体分子量大、穿透力有限、特异性低、稳定性不足等缺点，现已被广泛应用：

4、(1)筛选针对特定亚型的禽流感病毒纳米抗体，其可用于鉴定aiv抗原表位，建立快速、高效、简便的aiv诊断技术；

5、(2)纳米抗体可作为中和病毒试剂的材料来源，阻止病毒入侵、病毒释放或膜融合等过程的进行，从而达到治疗禽流感的效果；

6、(3)纳米抗体可与辣根过氧化物酶(hrp)共同组成融合蛋白探针，应用于禽流感等疫病的抗体竞争elisa检测；

7、(4)纳米抗体经生物素或胶体金标记后，可用于建立病原的夹心elisa和胶体金检测试纸条，相比于传统抗体建立的方法，用纳米抗体进行相关检测与诊断，具有成本低、环境要求低、操作难度低的优点；

8、(5)纳米抗体分子量小，在生物体中扩散速度快，可与酶、放射性同位素、荧光探针等结合，形成示踪剂，进行体内或体外成像，优化分子成像技术；

9、(6)由于纳米抗体的结构独特性，其可与his标签等多种标签融合形成复合物，对细胞或生物体内的蛋白质进行定位，从而了解目标蛋白的功能或使蛋白质定向失活，也可作为靶向生物分子，应用在靶向药物治疗领域。因此，有必要开发抗h7亚型禽流感纳米抗体。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种重组蛋白。

3、本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白相关的生物材料。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种偶联物。

5、本发明第五方面的目的，在于提供固相载体。

6、本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、第二方面的重组蛋白、第三方面的生物材料、和/或第四方面的偶联物在制备产品中的应用。

7、本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。

8、本发明第八方面的目的，在于提供本发明第一方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或第二方面的重组蛋白的制备方法。

9、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

10、本发明的第一个方面，提供抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

11、重链可变区，其包含氨基酸序列如seq id no.1所示的重链可变区中的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。

12、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列依次如seq id no.2、seq idno.3、seq id no.4所示，所述cdr是以imgt定义方案定义的。

13、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列依次如seq id no.5、seq idno.6、seq id no.7所示，所述cdr是以kabat定义方案定义的。

14、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列依次如seq id no.8、seq idno.9、seq id no.7所示，所述cdr是以chothia定义方案定义的。

15、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列依次如seq id no.10、seq idno.11、seq id no.12所示，所述cdr是以contact定义方案定义的。

16、优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包含：

17、a1)seq id no.1；或

18、a2)将seq id no.1经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与seqid no.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

19、a3)与seq id no.1具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％的同源性且与seq id no.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

20、优选地，所述抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段还包含fc片段。

21、本发明的第二个方面，提供一种重组蛋白，包含：本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；和

22、任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

23、优选地，所述的标签序列选自下组中的至少一种：his标签、gggs序列、flag标签。

24、本发明的第三个方面，提供与本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中至少一种：

25、b1)编码本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或第二个方面的重组蛋白的核酸分子；

26、b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；

27、b3)包含b1)所述核酸分子的载体；

28、b4)包含b2)所述表达盒的载体；

29、b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；

30、b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；

31、b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；

32、b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。

33、优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

34、优选地，所述细胞包含真核细胞和原核细胞中的至少一种；进一步包含真核细胞；更进一步为酵母细胞；再进一步为毕赤酵母。

35、优选地，所述编码本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列包含：

36、c1)如seq id no.13所示的核苷酸序列；或

37、c2)将seq id no.13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seqid no.13所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或

38、c3)与seq id no.13具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％的同源性，且与seq id no.13所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。

39、本发明的第四个方面，提供一种偶联物，包含：本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段和本发明第二个方面的重组蛋白中的至少一种；

40、以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、电子致密标记、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、放射性同位素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒和病毒外壳蛋白中的至少一种。

41、优选地，所述可检测标记物为荧光或发光标记物。

42、优选地，所述可检测标记物选自吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺、异鲁米诺、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的任意一种。

43、优选地，所述放射性同位素选自tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177和re-188中的至少一种。

44、优选地，所述药物为其他抗h7亚型禽流感的药物。

45、本发明的第五个方面，提供固相载体，其表面偶联有本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段和/或第二个方面的重组蛋白。

46、本发明的第六个方面，提供发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、第二个方面的重组蛋白、第三个方面的生物材料、第四个方面的偶联物、和/或第五个方面的固相载体在制备产品中的应用。

47、优选地，所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。

48、优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：

49、d1)预防h7亚型禽流感病毒感染；

50、d2)治疗和/或预防h7亚型禽流感感染所引起的疾病。

51、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

52、优选地，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。

53、优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：

54、e1)检测h7亚型禽流感病毒；

55、e2)诊断h7亚型禽流感感染所引起的疾病；

56、e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防h7亚型禽流感感染所引起的疾病。

57、优选地，所述疾病包含禽流感。

58、本发明的第七个方面，提供一种产品，所述产品包含f1)～f4)中至少一种：

59、f1)本发明第一个方面的抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；

60、f2)本发明第二个方面的重组蛋白；

61、f3)本发明第四个方面的偶联物；

62、f4)本发明第五个方面的固相载体。

63、优选地，所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。

64、优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：

65、d1)预防h7亚型禽流感病毒感染；

66、d2)治疗和/或预防h7亚型禽流感感染所引起的疾病。

67、优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

68、优选地，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。

69、优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：

70、e1)检测h7亚型禽流感病毒；

71、e2)诊断h7亚型禽流感感染所引起的疾病；

72、e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防h7亚型禽流感感染所引起的疾病。

73、优选地，所述疾病包含禽流感。

74、本发明第八个方面，在于提供本发明第一个方面的纳米抗体或其抗原结合片段、或第二方面的重组蛋白的制备方法，通过培养本发明第三个方面中的转基因细胞系得到。

75、本发明的有益效果是：

76、本发明提供了抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段，该抗h7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段对h7抗原的特异性强、亲和力高，可用于检测h7亚型禽流感病毒，诊断h7亚型禽流感感染所引起的疾病，治疗和/或预防h7亚型禽流感感染所引起的疾病的药物筛选。