一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法

本发明属于基因工程和微生物，具体涉及一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、合成生物学的核心理念是设计和创建新的生物系统或生命体，并为人类科学研究和实际应用所服务。设计一种高效的微生物细胞工程用于高附加值的生产是目前合成生物学的研究重点。细胞进化的趋势是从单倍体细胞到多倍体细胞。自然多倍体常见于真核生物中，如植物、动物和一些酵母菌。研究表明，多倍体也发生在一些细菌和古细菌中，如a.vinelandii、d.radiodurans和ebulopiscium。尽管细胞的多倍性在许多情况下仍未得到充分探索，其在生物过程和系统发育中的影响也不清楚，但由于染色体数量的增加，其遗传多样性大大增强，从而提高了细胞对环境压力的抵抗能力。多倍体细胞中的基因冗余可以防止可能在其他染色体中逃逸和持续存在的有害突变，使细胞能够稳健地生存。此外，染色体数量的增加也改变了细胞的全局转录、代谢和基因表达水平。

3、作为一种单倍体模式生物，大肠杆菌具有清晰的遗传背景和较快的生长速度，容易进行遗传操作。它被广泛用于遗传学和微生物生理学研究，是工业应用中最常用的细菌。因此，构建一个人工多倍体大肠杆菌可能会建立一个高效的底盘细胞来生产生物基产品，并探索原核生物中染色体数量的增加对细胞的影响。然而，发明人发现，目前鲜有针对大肠杆菌进行多倍体的研究报道。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法。本发明通过试验研究发现，ftsz是控制细胞分裂的主要基因，它以形成“z环”的形式招募其他分裂蛋白进行精密的调控细胞分裂过程。ftsz的弱表达低于其阈值可以阻止细胞分裂，从而阻止新一轮的染色体复制，同时仍然允许完成正在进行的复制过程。这种细胞成丝状生长，并含有数量增加的不正确分离的染色体，丝状细胞中的染色体呈丝状延伸分布于胞内。然而，长期抑制分裂会导致丝状细胞由于细胞周期停止运行而最终被裂解。相反，ftsz的强表达使细胞在正常分裂和染色体分离的情况下存活。因此，通过调节ftsz的表达水平到适当的浓度，从而成功构建多倍体大肠杆菌。进一步的，本申请还提出可借助生长必需基因的筛选压力维持多倍体的倍性，从而达到在不添加抗生素的情况下成功构建多倍体大肠杆菌。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明的第一个方面，提供一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法，所述方法包括：在大肠杆菌复制形成复制叉的过程中，将含有编码抗生素抗性基因的分裂基因弱表达控制元件插入到其中一个复制叉染色体的分裂基因的起始密码子之前，控制细胞在正常分裂的同时包含多条染色体，从而形成多倍体；其中，所述分裂基因具体为ftsz基因；所述控制元件中启动子-rbs表达元件的表达强度为不大于100a.u.。

4、需要说明的是，在本发明中，虽然以大肠杆菌为例，构建获得具有多倍体的大肠杆菌，但是基于本申请的发明构思，在其他单倍体生物中获得对应多倍体，同样在本发明的保护范围之内。

5、本发明的第二个方面，提供上述方法构建获得的多倍体大肠杆菌。

6、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

7、上述技术方案提供一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法，具体公开了通过调节分裂基因ftsz的表达水平到适当的浓度，从而成功构建出多倍体大肠杆菌，经试验验证，获得的多倍体大肠杆菌与原始单倍体大肠杆菌相比，其平均细胞体积和表面积增大，比表面积减少，其生长更慢，但是在lb培养基中培养至后期时，其生长更快；同时具有更强的乙酸盐耐受性，且染色体非常稳定，能增强蛋白质的表达，从而建立一种高效的底盘细胞来生产生物基产品，并可应用于原核生物中染色体数量的增加对细胞影响的研究，具有良好的实际应用之价值。

技术特征：

1.一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括：在大肠杆菌复制形成复制叉的过程中，将含有编码抗生素抗性基因的分裂基因弱表达控制元件插入到其中一个复制叉染色体的分裂基因的起始密码子之前，控制细胞在正常分裂的同时包含多条染色体，从而形成多倍体；所述弱表达控制元件中启动子-rbs表达元件的表达强度为不大于100a.u.；所述分裂基因为ftsz基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括但不限于卡那霉素抗性基因nptii、四环素抗性基因tetr和氯霉素乙酰基转移酶基因cmr。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有编码抗生素抗性基因的分裂基因弱表达控制元件具体由抗生素抗性基因-终止子-启动子-核糖体结合位点rbs组成。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述控制元件中启动子-rbs表达元件的表达强度为不大于60a.u.。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述终止子为bba_b1006。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子为表达强度较低的启动子，包括j23103、j23113和j23109，进一步为j23103；

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在大肠杆菌培养环境中，施加所述抗生素抗性基因所对应的抗生素形成筛选压力。

8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过引入生长必需基因从而无需添加抗生素构建多倍体大肠杆菌，其中，所述生长必需基因包括但不限于murc基因、muri基因、dnab基因、asps基因。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将生长必需基因构建在质粒中后转入大肠杆菌，随后敲除大肠杆菌基因组上的生长必需基因，在大肠杆菌复制形成复制叉的过程中，将含有编码抗生素抗性基因和生长必需基因的分裂基因弱表达控制元件插入到其中一个复制叉染色体的分裂基因的起始密码子之前，控制细胞在正常分裂的同时包含多条染色体，从而形成多倍体，最后将带有生长必需基因的质粒去除，即实现在不添加任何抗生素的情况下，得到最终的利用生长必需基因构建的多倍体大肠杆菌。

10.权利要求1-9任一项所述方法构建获得的多倍体大肠杆菌。

技术总结
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种利用调控分裂基因构建多倍体大肠杆菌的方法。本发明具体公开了通过调节分裂基因ftsZ的表达水平到适当的浓度，从而成功构建出多倍体大肠杆菌；同时，本发明还提供了通过生长必需基因构建无需添加抗生素的多倍体大肠杆菌的方法。经试验验证，获得的多倍体大肠杆菌染色体非常稳定，成功建立一种高效的底盘细胞来生产生物基产品，并将其可应用于原核生物中染色体数量的增加对细胞影响的研究，因此具有良好的实际应用之价值。

技术研发人员：梁泉峰,王苏蒙,祁庆生
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6