基于LAMP-CRISPR/Cas12a技术检测大丽轮枝菌的方法

本发明涉及微生物检测，特别涉及基于lamp-crispr/cas12a技术检测大丽轮枝菌的方法。

背景技术：

1、棉花是锦葵科(malvaceae)棉属(gossypium)植物，原产亚热带。棉花是世界上重要的经济作物之一。我国是世界前三的棉花生产国，已形成了以新疆为主，包括长江流域、黄河流域的三大产棉区。棉花黄萎病的发生一般可使棉花产量降低20％-30％，最高可达60％。棉花黄萎病在棉花生产中是为害极大，且具毁灭性的病害，被称为棉花上的"癌症"。病害一旦发生难以根除，苗期引起大量死苗，成株期蕾铃大量脱落、植株枯死，损失严重，结果造成严重减产。棉花黄萎病是由棉花黄萎病病原菌(黑白轮枝菌和大丽轮枝菌)引起、发生在棉花的病害。主要为害棉花的茎、枝、叶。在中国只存在大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)，大丽轮枝菌在土壤中主要以“微菌核”这种黑褐色休眠结构的形式存在，该结构可以在土壤中存活数年，能够低于不良环境，在遇到合适寄主或者在适宜环境下便会萌发产生侵染。由于该病病原宿主广泛，变异频繁，传播途径多样，存活时间长，难以通过常规控制方法有效地防治。建立棉花黄萎病菌的快速分子检测技术有助于该病害的综合防控。

2、目前常用的分子检测技术大多以大丽轮枝菌的基因内间隔区(intergenicspacer)、gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因、β-微管蛋白基因和转录内间隔区(internal scribed spacer)等设计引物检测土壤中大丽轮枝菌，但这些引物基于的片段序列，均与大丽轮枝菌的部分亲缘种有不同程度的重叠，且目前仍未见真正可以现场快速检测带菌土壤的方法。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提出基于lamp-crispr/cas12a技术检测大丽轮枝菌的方法，该方法具有易于操作、快速灵敏、鉴定结果准确及可实现现场检测等特点。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种基于lamp-crispr/cas12a技术检测大丽轮枝菌的方法，包括如下步骤：

4、(1)提取待测样品的基因组dna；

5、(2)采用lamp引物对步骤(1)中提取的待测样品的基因组dna在60～64℃条件下进行靶标dna扩增反应45～50min，得到lamp反应产物；

6、(3)使用lamp反应产物，cas12a蛋白，荧光基团和荧光淬灭基团标记的ssdna探针，crrna分子，建立lamp-crispr/cas12a检测体系，36～38℃反应30～60min，得到lamp-crispr/cas12a反应产物；所述crrna分子的核苷酸序列如seq id no.7所示；

7、(4)将得到的lamp-crispr/cas12a反应产物进行荧光强度检测，阳性为荧光，阴性无荧光。

8、本发明基于lamp-crispr/cas12a的技术原理，选取大丽轮枝菌基因为靶标序列并设计lamp引物，利用t7聚合酶体外转录合成指导rna。其流程为首先利用lamp引物对靶标dna进行快速扩增，该过程通常需要45到50分钟；随后以lamp反应为底物，利用cas12a蛋白、体外合成指导rna和单链探针进行裂解实验；用紫外灯照射管中反应液，肉眼观察结果，阳性呈绿色荧光，阴性无荧光。

9、进一步的，crispr/cas12a检测体系为：0.8～1.2μl 10×nebuffer r2.1，0.5～0.7μl 1μmcrrna，0.5～0.7μl 1μm engen lba cas12a(cpf1)，0.4～0.6μl rnaseinhibitor，0.8～1.2μl 2μmfam-bhq1标记ssdna报告基团，1.8～2.2μl 2.1m海藻糖溶液，无酶水补足7～8μl。

10、进一步的，所述crrna的获得方法，包括如下步骤：

11、s1：用合成相应的含t7启动子、重复序列和间隔序列的oligo短链退火，得到指导rna的dna模板；

12、步骤s1的反应体系为：15～25μl、50μm dnaoligo a，15～25μl、50μm dnaoligo b，15～25μl 5×退火缓冲液和35～45μl无酶水；

13、步骤s1的退火的反应程序为：94～96℃维持1.5～2.5min，而后每85～95s下降1℃，降至24～26℃；

14、s2、以步骤s1制备的指导rna的dna模板为体外模板，使用t7 quick high yieldrna synthesis kit进行转录，在36～38℃的条件下反应过夜，进行体外转录，合成指导rna，纯化稀释，得所述crrna；

15、体外转录合成的反应体系为：0.8～1.2μl指导rna的dna模板，2.8～3.2μl ntpmix，0.8～1.2μl t7 rnapolymerase mix，无酶水补足至30～35μl；反应过夜后加入40～45μl无酶水，2.8～3.2μl dnaseⅰ，36～38℃反应15～20min。

16、进一步的，步骤(2)中，所述lamp引物包括上游外引物vd-fip的核苷酸序列如seqid no.1所示，下游外引物vd-bip的核苷酸序列如seq id no.2所示，上游内引物vd-f3的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游内引物vd-b3的核苷酸序列如seq id no.4所示，上游环引物vd-lf的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游环引物vd-lb的核苷酸序列如seq idno.6所示；crrna与lamp靶标片段互补。

17、进一步的，靶标dna扩增反应体系为：0.81～0.85μl 10×thermopol buffer，0.4～0.6μl 100mm mgso4，0.44～0.48μl 25mm dntps，40μm vd-fip、vd-bip，5μm vd-f3、vd-b3，10μm vd-lf、vd-lb各0.31～0.35μl，0.31～0.35μl 8000u/ml bst2.0 warmstart dnapolymerase，0.31～0.35μl 5mm甜菜碱和0.8～1.2μl模板dna，灭菌超纯水补足9～10μl。

18、进一步的，步骤(3)中，所述探针的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述探针在5’端标记荧光基团fam，在5’端标记荧光淬灭基团bhq1。

19、进一步的，步骤(1)中，基因组dna的提取包括从土壤中提取待测样品的基因组dna，包括如下步骤：

20、步骤1：将土壤研磨，过筛，加入至裂解液终，摇晃震荡后，静置5min-10min待出现上清液；所述裂解液为ph 8.0、18～22mm的tris溶液、20～30mm的nacl溶液、2～3mm的edta溶液和质量分数0.02～0.07％的sds溶液；

21、步骤2：将滤纸条浸入上清液中蘸取，持续2～3s，结合核酸；

22、步骤3：将浸入过上清液的滤纸条浸入至清洗液中2～5次，每次浸入3～5s，清洗，得目标dna；所述清洗液为ph 8.0、8～12mm的tris溶液和质量分数0.05～0.15％的tween-20。

23、进一步的，土壤和裂解液的料液质量体积比为0.3～0.6g：700～900μl；

24、所述滤纸条在使用前还包括预处理步骤，预处理步骤包括：将滤纸条的一部分浸入至融化的石蜡中形成疏水区，石蜡凝固后，将滤纸条切成矩形，其中，所述矩形滤纸条含有涂蜡区和未涂蜡区，然后将所述矩形切成2～3mm宽的条带，形成具有核酸结合区和手柄区的滤纸条。

25、本发明还提供一种lamp-crispr/cas12a技术检测大丽轮枝菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的crrna分子，cas12a蛋白，上述的lamp引物，以及荧光基团和荧光淬灭基团标记的ssdna探针。

26、进一步的，所述探针的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述探针在5’端标记荧光基团fam，在5’端标记荧光淬灭基团bhq1。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

28、1、特异性强。可实现大丽轮枝菌verticillium dahliae的精准、快速鉴定。

29、2、灵敏度高。本发明对大丽轮枝菌基因组dna的检测灵敏度极高，每个反应可检测低至10fg基因组拷贝数。

30、3、结果准确。本发明通过lamp引物扩增和cas12a指导rna的靶向裂解，两步均具有检测特异性，确保检测结果的准确性和可靠性，且本发明研究的闭管检测技术，将lamp-crispr/cas12a的反应体系置于同一反应管中，可以避免lamp扩增后开盖造成的气溶胶污染，从而避免假阳性结果的产生。

31、4、实用性强。本发明通过一次合成体外指导rna，即可长期使用，且整个检测技术方法只需要在恒温条件下进行短时间反应，不需要贵重仪器设备，结果可直接通过紫外灯反应来判断，整个检测流程约1-1.5小时，能快速准确地检测出病原菌，结合快速提取土壤dna的方法后，可实现大丽轮枝菌的现场田间鉴定。