一种绿原酸生产强度提高的重组大肠杆菌

本发明涉及一种绿原酸生产强度提高的重组大肠杆菌，属于基因工程及生物工程。

背景技术：

1、绿原酸(chlorogenic acid，cga)是天然的酚酸类化合物，分子式为c16h18o9，相对分子质量为354.309。从结构上看，绿原酸是一分子咖啡酸和一分子奎宁酸缩合形成的脂。绿原酸具有较好的抗氧化、抗菌、抗炎和保护神经的活性，其在保健品和医药等行业表现出巨大的应用潜力。此外，绿原酸还可以作为紫锥菊中重要的化合物菊苣酸的前体物。近年来，绿原酸的生物合成受到了越来越多研究者的关注。

2、目前，绿原酸的生产主要依赖于植物提取法，但是其生产效率受到了季节和植物组织含量低等因素的影响。传统化学合成法合成绿原酸涉及到多步反应，得率较低，也不适用于大规模的生产。目前通过在大肠杆菌和酿酒酵母体内重构奎宁酸和咖啡酰辅酶a为核心的微生物合成途径，可以实现绿原酸的合成。然而，合绿原酸合成途径中咖啡酸和奎宁酸合成的两条途径代谢流通量不平衡，奎宁酸的合成受到制约，途径中左旋多巴易氧化阻碍了咖啡酰辅酶a的生成，从而限制了绿原酸的高效合成。因此，如何利用生物法合成绿原酸并获得较高产量是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种绿原酸生产强度提高的重组大肠杆菌，在出发菌株的基础上，表达了铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)来源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶hpabc。

2、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌表达了羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶。

3、在一种实施方式中，所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶cshqt来源于朝鲜蓟，其氨基酸序列如seq id no.9所示，核苷酸序列如seq id no.6所示。

4、在一种实施方式中，所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶nthqt来源于烟草(nicotiana tabacum)，其氨基酸序列如seq id no.10所示，核苷酸序列如seq id no.7所示。

5、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还具有如下一种或多种改进：

6、(1)降低3-脱氢奎宁酸脱水酶的表达；

7、(2)整合表达奎宁酸/莽草酸-5-脱氢酶。

8、在一种实施方式中，所述降低3-脱氢奎宁酸脱水酶的表达是利用起始密码子gtg替换大肠杆菌基因组上编码3-脱氢奎宁酸脱水酶基因arod的启示密码子atg，合理分配代谢流通量。

9、在一种实施方式中，所述整合表达奎宁酸/莽草酸-5-脱氢酶是将大肠杆菌来源的双功能酶奎宁酸/莽草酸-5-脱氢酶的编码基因ydib整合至基因组上编码莽草酸脱氢酶的基因aroe位点，增加奎宁酸的通量，大肠杆菌合成绿原酸的能力得到大幅度的提高。

10、在一种实施方式中，所述出发菌株是在大肠杆菌bl21(de3)δtyrrδmeni的基础上，表达了酪氨酸解氨酶fjtal、4-香豆酸:辅酶a连接酶at4cl1，3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶突变体arogfbr、分支酸变位酶tyrc，3-脱氢奎宁酸合成酶arob和甘油脱氢酶glda；所述大肠杆菌bl21(de3)δtyrrδmeni公开于论文《efficient production ofchlorogenic acid in escherichia coli via modular pathway and cofactorengineering》。

11、在一种实施方式中，所述pahpabc基因序列如seq id no.1所示。

12、在一种实施方式中，所述ydib基因序列如seq id no.2所示。

13、在一种实施方式中，所述arod基因序列如seq id no.3所示。

14、在一种实施方式中，替换起始密码子后的arod(gtg)基因序列如seq id no.4所示

15、在一种实施方式中，所述aroe基因序列如seq id no.5所示。

16、在一种实施方式中，arogfbr基因、tyrc基因、fjtal基因、at4cl1基因、arob基因和glda基因的核苷酸序列如表2所示。

17、在一种实施方式中，以petduet-1为表达载体，表达arogfbr基因、tyrc基因、ydib基因和nthqt基因。

18、在一种实施方式中，以pacycduet-1为表达载体，表达fjtal基因、pahpabc基因和at4cl1基因。

19、在一种实施方式中，以pcdfduet-1为表达载体，表达arob基因和glda基因。

20、本发明还提供了所述重组大肠杆菌在发酵生产绿原酸或其衍生物方面的应用。

21、本发明提供了生产绿原酸的方法，所述方法是利用所述的重组大肠杆菌发酵生产绿原酸。

22、在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至发酵体系中在37℃下培养3～4h，加入终浓度为0.1±0.01mm的iptg，在28～30℃，200～220r/min下诱导和进行绿原酸的合成，发酵48～72h。

23、在一种实施方式中，所述发酵体系含有：葡萄糖、甘油、(nh4)2so4、k2hpo4·3h2o、kh2po4、mgso4·7h2o、柠檬酸钠、维生素b1、酵母提取物、维生素c。

24、本发明提供了所述重组大肠杆菌在生产绿原酸及其衍生物中的应用。

25、在一种实施方式中，所述衍生物包括但不限于菊苣酸、绿原酸甲酯和绿原酸乙酯。

26、有益效果：

27、本发明以大肠杆菌bl21(de3)δtyrrδmeni为宿主，表达了铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)来源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶，优化咖啡酰辅酶a的合成；更换大肠杆菌基因组上编码3-脱氢奎宁酸脱水酶基因的起始密码子atg为gtg，降低arod的表达强度，合理分配通往奎宁酸和咖啡酰辅酶a的代谢流；再将编码大肠杆菌来源的双功能酶奎宁酸/莽草酸-5-脱氢酶的基因ydib整合至基因组上编码莽草酸脱氢酶的基因aroe位点，进而增大了奎宁酸的通量。本发明构建的工程菌株绿原酸生产强度有显著的提高，摇瓶水平发酵72h，绿原酸积累量达到1058mg/l，相对于出发菌株提高了72％。将利用本发明的方法得到的大肠杆菌工程菌株5l罐放大培养，发酵52h，发酵液中的绿原酸含量达4278mg/l，生产强度达到82.27mg/l/h，为工业化生产绿原酸提供了一种新思路。

技术特征：

1.一种绿原酸生产强度提高的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，表达了铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)来源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶hpabc。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还具有如下一种或多种改进：

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述降低3-脱氢奎宁酸脱水酶的表达是利用起始密码子gtg替换大肠杆菌基因组上编码3-脱氢奎宁酸脱水酶基因arod的启示密码子atg。

4.根据权利要求2或3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述双功能酶奎宁酸/莽草酸-5-脱氢酶的编码基因ydib整合至基因组上编码莽草酸脱氢酶的基因aroe所在位置。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，表达了羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶。

6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶为朝鲜蓟来源的cshqt或为烟草来源的nthqt。

7.根据权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述出发菌株是在大肠杆菌bl21(de3)δtyrrδmeni的基础上，表达了酪氨酸解氨酶fjtal、4-香豆酸:辅酶a连接酶at4cl1，3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶突变体arogfbr、分支酸变位酶tyrc，3-脱氢奎宁酸合成酶arob和甘油脱氢酶glda。

8.权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌在发酵生产绿原酸或其衍生物方面的应用。

9.一种生产绿原酸的方法，其特征在于，利用权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌发酵生产绿原酸。

10.一种提高大肠杆菌绿原酸生产强度的方法，其特征在于，表达铜绿假单胞菌来源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶hpabc，降低3-脱氢奎宁酸脱水酶的表达，和/或整合表达奎宁酸/莽草酸-5-脱氢酶。

技术总结
本发明公开了一种绿原酸生产强度提高的重组大肠杆菌，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌BL21(DE3)ΔtyrRΔmenI为宿主，表达了铜绿假单胞菌来源的4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶，降低了3‑脱氢奎宁酸脱水酶的表达强度，将编码大肠杆菌来源的双功能酶奎宁酸/莽草酸‑5‑脱氢酶的基因ydiB整合至基因组上编码莽草酸脱氢酶的基因aroE位点。构建的工程菌株摇瓶发酵72h，绿原酸积累量达到1058mg/L，5L发酵罐发酵52h，发酵液中的绿原酸含量达4278mg/L，生产强度达到82.27mg/L/h，为工业化生产绿原酸提供了一种新思路。

技术研发人员：周景文,胡明龙,曾伟主,陈坚
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11