一种miRNA核酸分子、药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种具有促进血管生成功能的经化学修饰的mirna核酸分子、包括该核酸分子的药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用，尤其在制备用于促进牙髓再生的药物中的应用。

背景技术：

1、随着人们生活习惯、饮食结构的改变，牙髓炎和牙髓坏死的发病率逐渐增高。年轻恒牙常因严重龋坏、外伤导致牙髓组织炎症或坏死，影响牙根正常发育，成人多因牙髓炎导致牙髓不可逆坏死。牙髓是一种高度血管化的结缔组织，牙髓内的血管仅通过根尖孔和根尖处的牙周组织相通，这种独特的血供方式限制了牙髓修复再生能力,当牙髓组织因感染而发生炎症时难以自行恢复。牙根未发育完全的年轻恒牙发生牙髓严重病变时目前临床上普遍通过根尖诱导成形术进行治疗，该方法是在消除感染的基础上通过诱导根尖部尚存的牙乳头细胞、牙髓细胞等增殖分化并诱导根尖部钙化以封闭根尖，但该方法预后受牙髓坏死时牙根发育程度、残存的具有再生能力的细胞量及活力限制，如果根尖部残留的细胞量不足或者细胞状态不佳，即使治疗后牙根能继续发育，也会出现根管壁厚度不足、牙根长度不足及根尖形态异常等问题。

2、此外，对牙髓坏死的年轻恒牙还可采用根尖屏障术治疗，该方法是通过在根尖处充填生物相容性材料进行物理封闭，但该治疗方法无法使牙根继续发育，因此会导致牙根长度不足、牙列不齐及萌出高度不足等后果。当牙根已经发育完全的恒牙发生不可逆性牙髓炎和牙髓坏死时，首选根管治疗，即彻底清理根管内坏死组织，扩大成形根管并对根管消毒后严密充填。这种治疗方式后根管内仅有充填材料，已丧失牙髓组织，缺乏氧气血供而使牙齿变脆，远期可能导致牙冠或牙根折裂；同时根管内缺乏免疫防御及神经末梢感觉，会导致生理防御功能缺失引起根尖创伤等。

3、2001年学者首次提出牙髓血运重建术，即在彻底有效的根管消毒基础上，刺穿牙髓和根尖周组织引起根管内出血，待形成血凝块后再将mta覆盖表面封闭根管口。该方法可通过血凝块为细胞提供良好的增殖分化微环境并获得少量类似牙髓的再生组织，在一定程度上可使牙根继续生长，但牙髓血运重建术无法恢复患牙生理功能，此外有研究结果表明术后髓腔内再生的组织为牙髓和肉芽组织混合物，并非健康牙髓，因此有生物学功能的牙髓再生是未来牙髓疾病治疗的趋势。但现阶段成熟恒牙牙髓再生存在许多难题，其中根管及根尖孔的特殊结构导致的血管网络难以重建是重中之重。组织再生过程中植入物需要充足的血供以获取氧气、营养物质并带走代谢废物以存活，然而，初移植时植入物只能完全依赖现有毛细血管扩散来的氧气，其最大扩散距离只有100-200um，超过这一距离细胞将因缺氧凋亡，极大降低了植入物的生存率。因此需要新的血管从宿主血管中萌发出来，穿透细胞外基质互相连接，但宿主血管长入速度十分缓慢，据研究，单个血管的平均延伸率为5um/h，在12mm长的根管中，微血管从根尖孔直线生长至髓腔大概需要100d。因此牙髓再生中组织快速形成自身局部微血管及与根尖周进行血管网络吻合以恢复血供是成熟恒牙牙髓再生的关键问题。

4、2005年，有学者通过干细胞移植探索牙本质-牙髓复合体的再生，发现了牙髓干细胞(dpscs)在牙髓再生方面的潜力，其牙髓干细胞位于牙髓微环境中靠近血管的战略位置，通过影响血管生成发挥着关键作用。dpscs具有强大的旁分泌能力，能释放促进血管生成所必需的生长因子和细胞因子，协调血管内皮细胞的迁移、增殖和毛细血管样结构的形成，加速功能性血管网络的形成。此外，dpscs的旁分泌信号还能调节血管生成因子的表达，营造有利于血管萌发和生长的环境。因此，利用dpscs促血管生成的策略是促牙髓再生十分有潜力途径。

5、微小rna(mirna)在推动干细胞介导的血管生成方面已展现出令人瞩目的前景。这些小型非编码rna可协调转录后基因表达，影响各种细胞生物学过程，包括血管生成。利用mirnas的血管生成能力，有望促进血管网络形成和牙髓再生。然而，mirnas容易被体液和组织中的核糖核酸酶降解，因而不稳定。它们向包括dpscs在内的靶细胞的有效传递也受到尺寸、电荷和结构障碍的阻碍，导致传递效率低下。

6、因此，需要开发一种能够将具有血管生成功能的mirna有效递送到dpscs在内的靶细胞中的递送体系，促进血管网络形成和牙髓再生。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有促进血管生成功能的经化学修饰的mirna核酸分子、包括该核酸分子的药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用，以解决目前牙体组织再生血管生成困难的问题，并实现加速血管网络的形成以促进牙体组织再生。

2、为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：

3、第一个方面，本发明提供一种经化学修饰的mirna核酸分子，所述经化学修饰的mirna核酸分子为选自具有促进血管生成功能的mir-126-3p、mir-21-3p、let-7b-5p和mir-210-3p的mirna核苷酸序列中的一个或多个碱基被化学修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被化学修饰的核酸分子。

4、优选地，所述经化学修饰的mirna核酸分子为在选自mir-126-3p、mir-21-3p、let-7b-5p和mir-210-3p的mirna核苷酸序列中的一个或多个碱基被lna或经甲氧基或氟取代的lna修饰；

5、其中，

6、所述lna的化学式为：

7、

8、所述经甲氧基取代的lna的化学式为：

9、

10、所述经氟取代的lna的化学式为：

11、

12、优选地，所述经化学修饰的mirna核酸分子为在选自mir-126-3p、mir-21-3p、let-7b-5p和mir-210-3p的mirna核苷酸序列中的5’端和3’端中的至少一端被如下所示的硫代磷酸酯修饰：

13、

14、优选地，所述mir-126-3p的核苷酸序列为ucguaccgugaguaauaaugcg，所述mir-21-3p的核苷酸序列为caacaccagucgaugggcugu，所述let-7b-5p的核苷酸序列为ugagguaguagguugugugguu，所述mir-210-3p的核苷酸序列为cugugcgugugacagcggcuga。

15、优选地，所述经化学修饰的mirna核酸分子为mir-126-3p的mirna核苷酸序列中的一个或多个碱基被lna、2’-o-me或2’-fluoro修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被硫代磷酸酯phosphorothioate修饰。

16、优选地，所述经化学修饰的mirna核酸分子为mir-126-3p的mirna核苷酸序列中的第3位g碱基、第6位c碱基、第10位g碱基、第13位u碱基、第18位a碱基插入lna修饰，第2位c碱基、第5位a碱基、第9位u碱基、第12位g碱基、第17位a碱基插入2’-o-me修饰，3’端插入硫代磷酸酯phosphorothioate修饰，标记为126-mod1；所述经化学修饰的mirna核酸分子为mir-126-3p的mirna核苷酸序列中的第1位u碱基、第6位c碱基、第11位a碱基、第16位u碱基和第21位c碱基插入2’-o-me修饰，第4位u碱基、第7位c碱基、第11位a碱基、第14为a碱基和第19位u碱基插入2’-fluoro修饰，5’端插入硫代磷酸酯phosphorothioate修饰，标记为126-mod2；所述经化学修饰的mirna核酸分子为mir-126-3p的mirna核苷酸序列中的第2位c碱基、第5位a碱基、第9位u碱基、第12位g碱基和第17位a碱基插入lna修饰，第3位g碱基、第8位g碱基、第13位u碱基、第18位a碱基和第22位g碱基插入2’-o-me修饰，5’端和3’端分别插入硫代磷酸酯phosphorothioate修饰，标记为126-mod3；优选地，所述经化学修饰的mirna核酸分子为126-mod1。

17、第二个方面，本发明还提供一种药物组合物，包括如上所述的经化学修饰的mirna核酸分子。

18、优选地，所述药物组合物还包括用于递送和控释所述经化学修饰的mirna核酸分子的载体。

19、优选地，所述载体为dna纳米材料，优选地为dna四面体核酸框架(tfnas)。

20、优选地，所述药物组合物为经化学修饰的mirna核酸分子负载在dna四面体核酸框架(tfnas)中的纳米药物递送颗粒，标记为mir@tdn；优选地为经化学修饰的mir-126-3p负载在dna四面体核酸框架(tfnas)中的纳米药物递送颗粒，标记为mir-126@tdn；更优选地为126-mod1负载在dna四面体核酸框架(tfnas)中的纳米药物递送颗粒，标记为126-mod1@tdn。

21、优选地，所述药物组合物的粒径为10-100nm，优选地为10-75nm，更优选地为10-50nm；在所述药物组合物中，126-mod1负载在dna四面体核酸框架(tfnas)中的负载率为10％-60％，优选地为30％-60％，更优选地为40％-60％。第三个方面，本发明还提供一种如上所述的药物组合物在制备用于促进牙体组织再生的药物中的应用。

22、优选地，所述组织再生包括牙髓再生、牙龈再生、骨再生、软骨再生、皮肤和黏膜再生、血管再生、肌肉和肌腱再生、心肌细胞再生、角膜再生、视网膜再生、外周神经元再生、中枢神经元再生、胰岛再生和脂肪再生中的至少一种，优选地为牙髓再生。

23、优选地，将mir@tdn转染至牙髓干细胞(dpscs)；优选地，将126-mod1@tdn转染至牙髓干细胞(dpscs)。

24、优选地，126-mod1@tdn能显著提高牙髓干细胞(dpscs)中的cd31、enos、hif-1α和vegfa的蛋白表达水平。

25、优选地，牙髓干细胞(dpscs)对126-mod1@tdn的吸收效率在吸收30分钟后为20％-30％、在吸收60分钟后为40％-60％。

26、优选地，126-mod1@tdn在牙髓干细胞(dpscs)中的摩尔浓度为100-300nmol/l，优选地为200nmol/l。

27、优选地，将mir@tdn转染至人脐静脉内皮细胞(huvec)；优选地，将126-mod1@tdn转染至人脐静脉内皮细胞(huvec)。

28、优选地，将凝胶、mir@tdn、牙髓干细胞(dpscs)和人脐静脉内皮细胞(huvec)的混合物注入体内牙齿或体外牙齿磨片中；优选地，将凝胶、126-mod1@tdn、牙髓干细胞(dpscs)和人脐静脉内皮细胞(huvec)的混合物注入体内牙齿或体外牙齿磨片中。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

30、(1)本发明提供的用于促进牙髓再生的药物组合物中，将具有促进血管生成功能的经化学修复的mir-126-3p(126-mod1)负载在dna四面体核酸框架(tfnas)中获得mir@tdn(或126-mod1@tdn)纳米药物递送颗粒，易于制备及验证，可为日后临床上治疗疾病提供更多选择；

31、(2)tdn可以高效携带micro rna入胞，本发明实施例的实验结果证明，牙髓干细胞(dpscs)对126-mod1@tdn的吸收效率在吸收30分钟后为20％-30％、在吸收60分钟后为40％-60％，说明本发明的126-mod1@tdn在被吸收30min或60min后即可递送micro rna入胞，显著提高了micro rna的作用效率；

32、(3)细胞增殖实验证明，本发明的mir@tdn(或126-mod1@tdn)药物组合物的细胞毒性较低，不影响细胞增殖，同时可促进细胞迁移，增强细胞生物学活性，因此可以认为该药物组合物毒性低、安全可靠；

33、(4)本发明经化学修饰的126-mod1@tdn药物组合物大大提升了micro rna的稳定性，防止其入胞后降解，确保126-mod1@tdn纳米药物递送复合材料将micro rna携带入胞后能够持续发挥作用，极大发挥药效，节约经济成本；

34、(5)本发明的mir@tdn(或126-mod1@tdn)药物组合物对牙髓干细胞(dpscs)的旁分泌成血管因子的促进效果显著，体内外实验证明，本发明的mir@tdn(或126-mod1@tdn)可以高效刺激牙髓干细胞(dpscs)的旁分泌成血管因子以促进血管内皮细胞成血管，为牙髓再生过程中成血管难题提供了十分有潜力的解决方案，对日后临床上实现牙髓再生有着重要的借鉴意义。