一种识别EB病毒gH/gL/gp42复合体蛋白的单克隆抗体4G12及其应用

本发明属于抗体，具体涉及一种识别eb病毒gh/gl/gp42复合体蛋白的单克隆抗体4g12及其应用。

背景技术：

1、eb病毒(ebv)，又被称为人类疱疹病毒4型，其发现是在1964年epstein和barr首次成功地从bu rkitt淋巴瘤细胞中将这一病毒分离出来，并在体外悬浮培养中建立了病毒株系。ebv属于γ亚科嗜淋巴细胞病毒属，是一种dna致瘤病毒。其颗粒由核心蛋白、衣壳、壳皮、囊膜等四种结构成分组成，其中核心蛋白紧密缠绕着病毒的dna。

2、ebv的主要感染方式是潜伏感染，超过90％的ebv感染者终身携带病毒但不表现出临床症状。然而，在一定的条件下，比如当机体免疫功能受损时，病毒会被激活并引发裂解期感染，这可能导致多种恶性肿瘤的发生。研究发现，ebv与多种癌症密切相关，包括鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、burkitt淋巴瘤，胃癌等。并且，ebv感染与多种自身免疫疾病(如多发性硬化症)的诱发密切相关。

3、目前仍没有有效的疫苗来预防ebv感染，并且也缺乏特异性的靶向治疗手段来治疗ebv相关疾病，或者减少ebv病毒负荷。对于传染性单核细胞增多症的治疗，通常采用抗病毒药物，如阿昔洛韦等，虽然这些药物可以一定程度上缓解症状，但无法完全清除b淋巴细胞内和咽喉部上皮细胞内的ebv。而对于ebv相关的肿瘤，治疗主要包括化疗和放疗，但这些传统疗法对于已经发生转移或复发的患者，治疗效果通常较差。

4、近年来，研究人员在ebv领域的研究取得许多进展，特别是在理解ebv与宿主细胞之间的相互作用和感染途径方面。例如，ebv表面的糖蛋白的gh/gl蛋白与gp42蛋白形成高亲和力的复合物，gp42通过与宿主hlaii类受体结合，介导ebv通过膜融合进入b细胞，从而引起b细胞感染。ebv进入上皮细胞则被认为是由ghgl蛋白与整合素受体或epha2受体之间的直接相互作用引发的。

5、在感染性疾病与肿瘤治疗领域，单克隆抗体已经证明具有巨大的潜力。单克隆抗体可以大规模生产，具有高亲和性和特异性，因此在临床应用中不良反应的风险较低。此外，可以通过改造这些抗体分子来增强其抗病毒效力，降低副作用。虽然单克隆抗体在其他感染性疾病与肿瘤治疗中已取得许多进展，但至今尚未有针对ebv的治疗或预防性单克隆抗体上市。因此，开发针对ebv的单克隆抗体，将为预防和治疗与ebv感染相关的疾病提供更为有效的工具和方法。其中，由于gh/gl/gp42在ebv病毒感染中的关键作用，针对gh/gl/gp42复合物的特异性抗体有望成为未来预防ebv感染与靶向治疗ebv相关疾病的手段。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种重组蛋白。

3、本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白相关的生物材料。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种偶联物。

5、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面的重组蛋白、第三方面的生物材料、和/或第四方面的偶联物在制备产品中的应用。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种试剂盒。

7、本发明第七方面的目的，在于提供一种药物。

8、本发明第八方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。

9、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

10、本发明的第一个方面，提供一种抗ebv gh/gl/gp42复合体的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链：

11、所述重链包含：

12、重链可变区，其包含所述重链可变区的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述重链可变区具有seq id no：16所示的氨基酸序列；

13、所述轻链包含：

14、轻链可变区，其包含所述轻链可变区的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，所述轻链可变区具有seq id no：30所示的氨基酸序列。

15、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列依次如seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22、seq id no：33、seq id no：34、seq id no：32所示，所述cdr是以kabat定义方案定义的。

16、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l3的氨基酸序列依次如seq idno：17、seq id no：18、seq id no：19、seq id no：31、seq id no：32所示，所述cdr-l2的氨基酸序列为：dvs，所述cdr是以imgt定义方案定义的。

17、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列依次如seq id no：23、seq id no：24、seq id no：22、seq id no：33、seq id no：34、seq id no：32所示，所述cdr是以chothia定义方案定义的。

18、优选地，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列依次如seq id no：25、seq id no：26、seq id no：27、seq id no：35、seq id no：36、seq id no：37所示，所述cdr是以contact定义方案定义的。

19、优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包含：

20、a1)seq id no.16；或

21、a2)将seq id no.16经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与seqid no.16所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

22、a3)与seq id no.16具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与seq idno.16所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

23、所述轻链可变区的氨基酸序列包含：

24、b1)seq id no.30；或

25、b2)将seq id no.30经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与seqid no.30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

26、b3)与seq id no.30具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与seq idno.30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

27、优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、双特异性抗体、多特异性抗体中的至少一种。

28、优选地，所述重链还包含重链恒定区；和/或

29、所述轻链还包含轻链恒定区。

30、优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列包含：

31、c1)seq id no：15中第146～475位氨基酸组成的氨基酸序列；或

32、c2)将c1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与c1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

33、c3)与c1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与c1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

34、优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：

35、d1)seq id no：29中第131～236位氨基酸组成的氨基酸序列；或

36、d2)将d1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与d1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

37、d3)与d1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与d1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

38、优选地，所述重链还包含重链信号肽；和/或

39、所述轻链还包含轻链信号肽。

40、优选地，所述重链信号肽的氨基酸序列包含：

41、e1)seq id no：15中第1～19位氨基酸组成的氨基酸序列；或

42、e2)将e1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与e1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

43、e3)与e1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与e1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

44、优选地，所述轻链信号肽的氨基酸序列包含：

45、f1)seq id no：29中第1～19位氨基酸组成的氨基酸序列；或

46、f2)将f1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与f1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

47、f3)与f1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与f1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

48、优选地，所述ebv gh/gl/gp42复合体的氨基酸序列包含：

49、g1)seq id no：5中第1～114和第130～789位氨基酸和seq id no：6中第1～190为氨基酸组成的氨基酸序列；或

50、g2)将g1)所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与g1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

51、g3)与g1)所述的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与g1)所述的氨基酸序列的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

52、本发明的第二个方面，提供一种重组蛋白，包含：本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；和

53、任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

54、优选地，所述的标签序列选自下组中的至少一种：his标签、gggs序列、flag标签；进一步为his标签；更进一步为6×his标签。

55、本发明的第三个方面，提供与本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含h1)～h16)中至少一种：

56、h1)编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、或第二个方面的重组蛋白的核酸分子；

57、h2)包含h1)所述核酸分子的表达盒；

58、h3)包含h1)所述核酸分子的载体；

59、h4)包含h2)所述表达盒的载体；

60、h5)包含h1)所述核酸分子的转基因细胞系；

61、h6)包含h2)所述表达盒的转基因细胞系；

62、h7)包含h3)所述载体的转基因细胞系；

63、h8)包含h4)所述载体的转基因细胞系；

64、h9)包含h1)所述核酸分子的微生物；

65、h10)包含h2)所述表达盒的微生物；

66、h11)包含h3)所述载体的微生物；

67、h12)包含h4)所述载体的微生物；

68、h13)包含h1)所述核酸分子的病毒；

69、h14)包含h2)所述表达盒的病毒；

70、h15)包含h3)所述载体的病毒；

71、h16)包含h4)所述载体的病毒。

72、优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

73、优选地，所述编码如本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包含编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子和编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子。

74、优选地，所述编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子的核苷酸序列包含：

75、a211)如seq id no：28所示的核苷酸序列；或

76、a212)将seq id no：28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no：28所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或

77、a213)与seq id no：28具有80％、85％或90％以上的同源性，且与seq id no：28所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；

78、所述编码本发明第一个方面的所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子的核苷酸序列包含：

79、a221)如seq id no：38所示的核苷酸序列；或

80、a222)将seq id no：38经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no：38所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或

81、a223)与seq id no：38具有80％、85％或90％以上的同源性，且与seq id no：38所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。

82、本发明的第四个方面，提供一种偶联物，包含：本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和本发明第二个方面的重组蛋白中的至少一种；

83、以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。

84、优选地，所述可检测标记物选自放射性同位素，荧光物质，化学发光物质，有色物质，或其任意组合。

85、优选地，所述偶联物选自：荧光物质、化学发光标记物、有色物质、放射性同位素、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

86、本发明的第五个方面，提供发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二个方面的重组蛋白、第三个方面的生物材料、和/或第四个方面的偶联物在制备产品中的应用；

87、所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。

88、优选地，所述药物具有i1)～i2)中至少一种功能：

89、i1)预防eb病毒感染；

90、i2)治疗和/或预防eb病毒感染所引起的疾病。

91、优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有j1)～j3)中至少一种功能：

92、j1)检测gh/gl/gp42复合体蛋白在样品中的存在或水平；

93、j2)检测eb病毒；

94、j3)诊断eb病毒感染所引起的疾病。

95、优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、nk/t细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。

96、优选地，所述药物包含疫苗。

97、本发明的第六个方面，提供一种产品，所述产品包含k1)～k3)中至少一种：

98、k1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；

99、k2)本发明第二个方面的重组蛋白；

100、k3)本发明第四个方面的偶联物；

101、所述产品包含试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。

102、优选地，所述产品具有j1)～j3)中至少一种功能：

103、j1)检测gh/gl/gp42复合体蛋白在样品中的存在或水平；

104、j2)检测eb病毒；

105、j3)诊断eb病毒感染所引起的疾病。

106、优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、nk/t细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。

107、本发明的第七个方面，提供一种药物，所述药物包含l1)～l4)中至少一种：

108、l1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；

109、l2)本发明第二个方面的重组蛋白；

110、l3)苯发明第三个方面的生物材料；

111、l4)本发明第四个方面的偶联物。

112、优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。

113、优选地，所述药物具有i1)～i2)中至少一种功能：

114、i1)预防eb病毒感染；

115、i2)治疗和/或预防eb病毒感染所引起的疾病。

116、优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、nk/t细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。

117、优选地，所述药物包含疫苗。

118、优选地，一种疫苗，包含l1)～l4)中至少一种和佐剂：

119、l1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；

120、l2)本发明第二个方面的重组蛋白；

121、l3)苯发明第三个方面的生物材料；

122、l4)本发明第四个方面的偶联物。

123、本发明第八个方面，在于提供本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白的制备方法，通过培养本发明第三个方面中的转基因细胞系、微生物或病毒得到。

124、本发明的有益效果是：

125、本发明提供了一种抗ebv gh/gl/gp42复合体的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段对gh/gl/gp42复合体蛋白有较高的亲和力(kd(m)＝1.248e-09)，可以显著抑制ebv对于上皮细胞以及b细胞的感染，在体内有效保护ebv感染的人源化小鼠，可用于检测gh/gl/gp42复合体蛋白在样品中的存在或水平、检测eb病毒、诊断eb病毒感染所引起的疾病、预防eb病毒感染和/或治疗和/或预防eb病毒感染所引起的疾病。