本发明涉及疫苗制备，具体涉及一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法。
背景技术：
1、在原代细胞培养中,鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,cef)得到普遍应用，与其他细胞相比,cef来源于spf鸡胚，相对容易获得,体外培养呈贴壁生长，增殖能力强，适应性强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化。由于spf鸡胚纯净，无母源抗体，无家禽主要的传染病和人畜共患病、无对实验研究可能产生干扰的病原微生物，在病毒学和生物制品等方面意义巨大。目前鸡胚成纤维细胞根据其培养条件分为附着于容器表面上生长型(贴壁依赖型)或自由悬浮生长型。
2、转瓶贴壁培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等优点，但其缺点同样突出：工艺复杂，占地面积大。
3、细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养基内生长增殖的一种培养方法，细胞能达到较高密度，可用于多种产品生产。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽用生物制品行业发展的必然趋势。然而目前细胞悬浮培养技术大多采用传代细胞进行培养，培养的病毒有致瘤性风险，并且病毒效价达不到预期。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，包括以下步骤：
4、(1)将鸡胚消化：将10日龄鸡胚预处理后，采用以胰蛋白酶进行消化，消化结束后用缓冲生理盐水脱酶，得鸡胚消化液；
5、(2)制备细胞悬浮液：将鸡胚消化液和含5％胎牛血清的培养基置于培养瓶中，鸡胚消化液和培养基体积少于培养瓶体积的4/5，将培养瓶置于磁力搅拌器搅拌后，静置沉淀，去上清液，再对培养瓶中的沉淀加入胰蛋白酶消化多次，然后对细胞进行计数，2-8℃保存，备用；
6、(3)生物反应器培养：将步骤(2)细胞悬浮液用预热的含5％胎牛血清的培养基将细胞悬浮液稀释至细胞密度为1.0-2.0×106cells/ml，转移到生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速为50-120rpm，温度为36.5-37.5℃，ph为6.9-7.3，溶氧为30-50％，生长48-72h，至细胞密度为4-5.0×106cells/ml时，即得。
7、优选地，所述预处理具体步骤是：将10日龄鸡胚有空气部分朝上放置，用75％酒精棉球消毒鸡胚气室，静置待气室表面酒精干燥后，用剪刀剪去气室部位的蛋壳，撕开胚胎胎膜；用镊子夹住鸡胚头部或双腿将鸡胚挑出，移入平皿中，去除鸡胚眼睛和大脑部分，将鸡胚转移到烧杯中；用镊子搅拌以清洗鸡胚上附着的蛋黄、血水等，缓慢倒出洗液后再加入缓冲生理盐水连续清洗鸡胚2次后，用组织剪将鸡胚剪碎；再用缓冲生理盐水清洗至少2次。
8、优选地，所述胰蛋白酶是温度为36-40℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶，每枚鸡胚使用6-8ml，消化时间为12-15min，并且每隔4-5min轻柔转动1次。
9、优选地，所述缓冲生理盐水的ph为7.0-7.3，脱酶至少3次。
10、优选地，步骤(2)中，磁力搅拌时间为30-60s，上清液采用9层纱布袋过滤，再在沉淀中加入0.25％胰蛋白酶溶液，对沉淀组织继续消化和搅拌3次，搅拌时间依次为1分、2分、3分钟。
11、优选地，在步骤(3)中，细胞悬浮液的初始密度为1.0×106cells/ml、1.2×106cells/ml、1.4×106cells/ml、1.6×106cells/ml、1.8×106cells/ml的接种密度转移到细胞生物反应器中进行悬浮培养。
12、优选地，将细胞按照初始密度为1.6×106cells/ml的接种密度接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养。
13、优选地，所述培养基包括以下重量份数的原料：199营养液90-98份、7.5％碳酸氢钠溶液2-3份、2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基3-5份、海藻糖0.2-0.5份、半胱氨酸0.001-0.01份、精氨酸0.001-0.01份、烟酸0.001-0.01份。
14、优选地，所述培养基包括以下重量份数的原料：199营养液95份、7.5％碳酸氢钠溶液2份、2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基3份、海藻糖0.3份、半胱氨酸0.005份、精氨酸0.005份、烟酸0.005份。
15、优选地，在步骤中(3)中，加入生物反应器前用预热的培养基温度为34-38℃。
16、本发明的技术效果和优点：
17、(1)本发明对199营养液采用2.95％胰蛋白示磷酸盐培养基、半胱氨酸、精氨酸和烟酸进行改良后，使得原代细胞可以在生物反应器进行悬浮细胞培养，结合生物反应器在50-120rpm转速下进行培养，降低细胞对贴壁的依赖，从而提高原代细胞悬浮生长率，使悬浮细胞能够大规模生长在生物反应器中，相对与转瓶培养和细胞工厂培养，大大降低了生产成本，并且生物反应器培养的细胞终端产品均一性、稳定性高，产品产量提高，易于规模化生产。
18、(2)本发明采用原代细胞培养，无需进行特殊的驯化，将细胞直接在培养基中生长、增殖、分化，培养基包含细胞所需的生长和分化因子，以及适量的营养物质和金属离子，使细胞获得最自然的生长环境，实现更高效的细胞增殖和分化。
1.一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述预处理具体步骤是：将10日龄鸡胚有空气部分朝上放置，用75％酒精棉球消毒鸡胚气室，静置待气室表面酒精干燥后，用剪刀剪去气室部位的蛋壳，撕开胚胎胎膜；用镊子夹住鸡胚头部或双腿将鸡胚挑出，移入平皿中，去除鸡胚眼睛和大脑部分，将鸡胚转移到烧杯中；用镊子搅拌以清洗鸡胚上附着的蛋黄、血水等，缓慢倒出洗液后再加入缓冲生理盐水连续清洗鸡胚2次后，用组织剪将鸡胚剪碎；再用缓冲生理盐水清洗至少2次。
3.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶是温度为36-40℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶，每枚鸡胚使用6-8ml，消化时间为12-15min，并且每隔4-5min轻柔转动1次。
4.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述缓冲生理盐水的ph为7.0-7.3，脱酶至少3次。
5.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，步骤(2)中，磁力搅拌时间为30-60s，上清液采用9层纱布袋过滤，再在沉淀中加入0.25％胰蛋白酶溶液，对沉淀组织继续消化和搅拌3次，搅拌时间依次为1分、2分、3分钟。
6.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，在步骤(3)中，细胞悬浮液的初始密度为1.0×106cells/ml、1.2×
7.根据权利要求6所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，将细胞按照初始密度为1.6×106cells/ml的接种密度接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养。
8.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，
9.根据权利要求8所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，
10.根据权利要求1所述一种鸡胚成纤维细胞悬浮培养方法，其特征在于，在步骤中(3)中，加入生物反应器前用预热的培养基温度为34-38℃。