融合蛋白及其用途的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及融合蛋白及其用途。

背景技术：

1、脂肪体(adiposome)是由单分子磷脂膜包裹中性脂核心的纳米小球，其与天然存在的脂滴和脂蛋白结构类似。脂肪体可招募一种或几种固有蛋白和/或功能蛋白、获得人工脂滴，也可招募一种或几种载脂蛋白、获得人工脂蛋白，均在制备药物和/或药物载体中具有重要作用。作为一种新型的纳米载体，脂肪体的中性脂核心可以装载大量亲脂性药物，且具有良好的生物相容性。

2、与目前临床使用的纳米载体如白蛋白，脂质体等纳米药物的缺陷类似，脂肪体也不具备靶向性。因此，以脂肪体为载体的药物会被运送到身体的正常组织，而这可能会导致许多的副作用。因此，使纳米载体具备靶向可以有效地将药物传递到患病组织或细胞，减少药物对健康组织的损害，从而更好的用于癌症、传染病和代谢疾病等疾病的治疗。

3、目前，常用于实现纳米载体靶向的方法是通过共价结合的表面修饰，通过共价键将靶向配体或抗体固定在纳米粒子表面上，如在脂质体中加入糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰的聚乙二醇化磷脂靶向脑组织。但是，脂肪体作为一个新型的纳米颗粒，是一个由单分子磷脂膜包裹中性脂核心的纳米小球，现有的纳米载体靶向修饰技术对脂肪体的应用效果并不好。因此，脂肪体特有的靶向的方法和策略仍亟需解决。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供融合蛋白及其用途。本发明通过脂肪体靶向融合蛋白的构建并将其招募至脂肪体上从而实现脂肪体的靶向性，并可用于药物递送、疫苗制备等领域，从而用于癌症、传染病和代谢疾病等疾病的治疗。

2、本发明提供一种融合蛋白，包括片段a和片段b；其中：

3、片段a靶向识别单分子磷脂膜；

4、片段b靶向识别组织或细胞。

5、本发明所述的融合蛋白包括至少一个片段a和至少一个片段b，本发明对它们的连接顺序不做限定。

6、本发明中，所述的融合蛋白的结构为：

7、[(片段a)x-(片段b)y]z或[(片段b)x-(片段a)y]z；

8、其中：x表示片段a的重复数，y表示片段b的重复数，z表示融合蛋白中由片段a和片段b组成的单元的重复数。x、y、z独立的选自不为0的整数。例如，1≤x≤10，1≤y≤10，1≤z≤10。x、y、z可以相等也可以不相等，本发明对此不作限定。以x＝1、y＝1且z＝1为例，本发明所述融合蛋白的结构为片段a-片段b或为片段b-片段a。

9、当片段重复数不为1，两个重复片段的序列可以相同，也可以不同，本发明对此不做限定。例如，当y＝2，两个片段b可靶向相同的组织或细胞，也可以靶向不同的组织或细胞，本发明对此不做限定。当z＝2，两个重复单元中的片段可以相同也可以不同，本发明对此亦不做限定。以x＝1、y＝2且z＝2为例，本发明所述融合蛋白的结构为：

10、[片段a-片段b2]2，即：片段a-片段b-片段b-片段a-片段b-片段b；

11、或[片段b-片段a2]2，即：片段b-片段a-片段a-片段b-片段a-片段a。

12、为了保持片段a和片段b结构的完整，融合蛋白中可以包括linker也可以不包括，本发明对此不做限定。本发明中，所述linker位于两个相邻的片段之间，例如片段a与片段b之间，或者两个片段a之间，或者两个片段b之间，本发明对此不做限定。可选择地，所述linker的长度为2～20个氨基酸，或者为5～15个氨基酸，或者为10～15个氨基酸，本发明对此亦不做限定。例如，所述linker为(ggggs)n、gn、(eaaak)n、(xp)n、a(eaaak)4alea(eaaak)4a、papap、vsqtskltraetvfpdv、plglwa、trhrqprgwe、agnrvrrsvg、rvlaea、edvvccsmsy、edvvccsmsy或ggiegrgs，其中，n为不为零的整数。或者，所述linker为可剪切linker或自剪切linker。所述可剪切linker的氨基酸序列为leagcknffprsftscgsle，所述自剪切linker为p2a、t2a或者e2a。

13、本发明中，片段a靶向单分子磷脂膜，由于脂肪体具有单分子磷脂膜这一显著特性，因而片段a能够靶向脂肪体。

14、一些实施例中，片段a靶向的单分子磷脂膜包含磷脂、功能性极性脂质与阳离子脂质中的一种或多种；

15、所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂与鞘磷脂中的一种或多种；

16、所述功能性极性脂选自聚乙二醇修饰固醇、生物素修饰固醇、氨基酸修饰固醇、多肽修饰固醇、多糖修饰固醇、核酸修饰固醇、聚乙二醇修饰磷脂、生物素修饰磷脂、氨基酸修饰磷脂、多肽修饰磷脂、多糖修饰磷脂与核酸修饰磷脂中的一种或多种；

17、所述阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、2,3-二油酰氧基-n-[2-(精胺甲酰氨基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙胺盐酸盐、1,2-二油酰-sn-甘油-3-[(n-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)与3β-[n-(n',n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐中的一种或多种。

18、靶向单分子磷脂膜的肽段通常是脂滴蛋白、人工设计的可以定位在细胞脂滴上的肽段和载脂蛋白中的一段序列等。能够定位在脂滴上的载脂蛋白和肽段都可以用来作为特异性识别单分子磷脂膜的肽段(片段a)，以下是可以通过非共价的方式特异性结合到脂肪体表面的肽段：包括但不限于aamb、aldi、cyb5r3-n、ldamp1、hsd17b13-n28、mdt-28-p、mlds-p、dhs-3-p、hsd17b11-n28、pspa-h1、vipp1-h1、snf7-h1、chmp1b-h1、pb、pe和pf。

19、表1片段a的名称和氨基酸序列

20、

21、

22、本发明所述的片段a的氨基酸序列如表1中任一项所示，或者与表1中所述多肽的氨基酸序列具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列。

23、本发明中，片段b靶向识别组织或细胞。所述的组织或细胞来自人体或动物体，其为肿瘤、被病原感染的器官、代谢性疾病的病灶和/或健康的组织或细胞。本发明中，靶向特异性组织或细胞肽段的选择取决于要靶向的组织或细胞表面的特异蛋白。一些实施例中，所述片段b包括但不限于：nrp-b、trf-b、ldlr-b、erbb2-b、cxcr4-b、grp78-b或soma-b中至少一种。

24、表2片段b的名称和氨基酸序列及靶向蛋白

25、

26、本发明所述的片段b的氨基酸序列如表2中任一项所示，或者与表2中所述多肽的氨基酸序列具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列。

27、可选择的，本发明所述融合蛋白由片段a和片段b连接而成，例如，所述融合蛋白为：

28、aamb-nrp-b、aamb-trf-b、aamb-ldlr-b、aamb-erbb2-b、aamb-cxcr4-b、aamb-grp78-b、aamb-soma-b、nrp-b-aamb、trf-b-aamb、ldlr-b-aamb、erb b2-b-aamb、cxcr4-b-aamb、grp78-b-aamb、soma-b-aamb、aldi-nrp-b、ald i-trf-b、aldi-ldlr-b、aldi-erbb2-b、aldi-cxcr4-b、aldi-grp78-b、aldi-so ma-b、nrp-b-aldi、trf-b-aldi、ldlr-b-aldi、erbb2-b-aldi、cxcr4-b-aldi、grp78-b-aldi、soma-b-aldi、cyb5r3-n-nrp-b、cyb5r3-n-trf-b、cyb5r3-n-ldlr-b、cyb5r3-n-erbb2-b、cyb5r3-n-cxcr4-b、cyb5r3-n-grp78-b、cyb5r3-n-soma-b、nrp-b-cyb5r3-n、trf-b-cyb5r3-n、ldlr-b-cyb5r3-n、erbb2-b-cyb5r3-n、cxcr4-b-cyb5r3-n、grp78-b-cyb5r3-n、soma-b-cyb5r3-n、ldamp1-nrp-b、lda mp1-trf-b、ldamp1-ldlr-b、ldamp1-erbb2-b、ldamp1-cxcr4-b、ldamp1-grp 78-b、ldamp1-soma-b、nrp-b-ldamp1、trf-b-ldamp1、ldlr-b-ldamp1、erbb2-b-ldamp1、cxcr4-b-ldamp1、grp78-b-ldamp1、soma-b-ldamp1、hsd17b13-n28-nrp-b、hsd17b13-n28-trf-b、hsd17b13-n28-ldlr-b、hsd17b13-n28-erbb2-b、hsd17b13-n28-cxcr4-b、hsd17b13-n28-grp78-b、hsd17b13-n28-soma-b、nrp-b-hsd17b13-n28、trf-b-hsd17b13-n28、ldlr-b-hsd17b13-n28、erbb2-b-hsd17b13-n28、cxcr4-b-hsd17b13-n28、grp78-b-hsd17b13-n28、soma-b-hsd17b13-n28、mdt-28-p-nrp-b、mdt-28-p-trf-b、mdt-28-p-ldlr-b、mdt-28-p-erbb2-b、mdt-28-p-cxcr4-b、mdt-28-p-grp78-b、mdt-28-p-soma-b、nrp-b-mdt-28-p、trf-b-mdt-28-p、ldlr-b-mdt-28-p、erbb2-b-mdt-28-p、cxcr4-b-mdt-28-p、grp78-b-mdt-28-p、soma-b-mdt-28-p、mlds-p-nrp-b、mlds-p-trf-b、mlds-p-ldlr-b、mlds-p-erbb2-b、mlds-p-cxcr4-b、mlds-p-grp78-b、mlds-p-soma-b、nrp-b-mlds-p、trf-b-mld s-p、ldlr-b-mlds-p、erbb2-b-mlds-p、cxcr4-b-mlds-p、grp78-b-mlds-p、so ma-b-mlds-p、dhs-3-p-nrp-b、dhs-3-p-trf-b、dhs-3-p-ldlr-b、dhs-3-p-erbb2-b、dhs-3-p-cxcr4-b、dhs-3-p-grp78-b、dhs-3-p-soma-b、nrp-b-dhs-3-p、trf-b-dhs-3-p、ldlr-b-dhs-3-p、erbb2-b-dhs-3-p、cxcr4-b-dhs-3-p、grp78-b-dhs-3-p、so ma-b-dhs-3-p、hsd17b11-n28-nrp-b、hsd17b11-n28-trf-b、hsd17b11-n28-ldlr-b、hsd17b11-n28-erbb2-b、hsd17b11-n28-cxcr4-b、hsd17b11-n28-grp78-b、hsd17b11-n28-soma-b、nrp-b-hsd17b11-n28、trf-b-hsd17b11-n28、ldlr-b-hsd17b11-n28、erbb2-b-hsd17b11-n28、cxcr4-b-hsd17b11-n28、grp78-b-hsd17b11-n28、som a-b-hsd17b11-n28、pspa-h1-nrp-b、pspa-h1-trf-b、pspa-h1-ldlr-b、pspa-h1-erb b2-b、pspa-h1-cxcr4-b、pspa-h1-grp78-b、pspa-h1-soma-b、nrp-b-pspa-h1、tr f-b-pspa-h1、ldlr-b-pspa-h1、erbb2-b-pspa-h1、cxcr4-b-pspa-h1、grp78-b-pspa-h1、soma-b-pspa-h1、vipp1-h1-nrp-b、vipp1-h1-trf-b、vipp1-h1-ldlr-b、vip p1-h1-erbb2-b、vipp1-h1-cxcr4-b、vipp1-h1-grp78-b、vipp1-h1-soma-b、nrp-b-vipp1-h1、trf-b-vipp1-h1、ldlr-b-vipp1-h1、erbb2-b-vipp1-h1、cxcr4-b-vipp1-h1、grp78-b-vipp1-h1、soma-b-vipp1-h1、snf7-h1-nrp-b、snf7-h1-trf-b、snf7-h1-ldlr-b、snf7-h1-erbb2-b、snf7-h1-cxcr4-b、snf7-h1-grp78-b、snf7-h1-so ma-b、nrp-b-snf7-h1、trf-b-snf7-h1、ldlr-b-snf7-h1、erbb2-b-snf7-h1、cxcr 4-b-snf7-h1、grp78-b-snf7-h1、soma-b-snf7-h1、chmp1b-h1-nrp-b、chmp1b-h1-trf-b、chmp1b-h1-ldlr-b、chmp1b-h1-erbb2-b、chmp1b-h1-cxcr4-b、chmp 1b-h1-grp78-b、chmp1b-h1-soma-b、nrp-b-chmp1b-h1、trf-b-chmp1b-h1、ldl r-b-chmp1b-h1、erbb2-b-chmp1b-h1、cxcr4-b-chmp1b-h1、grp78-b-chmp1b-h1、soma-b-chmp1b-h1、pb-nrp-b、pb-trf-b、pb-ldlr-b、pb-erbb2-b、pb-cxcr 4-b、pb-grp78-b、pb-soma-b、nrp-b-pb、trf-b-pb、ldlr-b-pb、erbb2-b-pb、cxc r4-b-pb、grp78-b-pb、soma-b-pb、pe-nrp-b、pe-trf-b、pe-ldlr-b、pe-erbb2-b、pe-cxcr4-b、pe-grp78-b、pe-soma-b、nrp-b-pe、trf-b-pe、ldlr-b-pe、erbb2-b-pe、cxcr4-b-pe、grp78-b-pe、soma-b-pe、pf-nrp-b、pf-trf-b、pf-ldlr-b、pf-er bb2-b、pf-cxcr4-b、pf-grp78-b、pf-soma-b、nrp-b-pf、trf-b-pf、ldlr-b-pf、er bb2-b-pf、cxcr4-b-pf、grp78-b-pf、soma-b-pf。

29、进一步的，本发明还提供了与前述融合蛋白相关的生物材料：包括如下任一项：

30、i)、编码如前所述融合蛋白的核酸；

31、ii)、含有i)所述核酸的表达单元；

32、iii)、含有i)所述核酸或ii)所述表达单元的载体；

33、iv)、转化或转染有iii)所述载体的宿主；

34、v)、iv)所述宿主的表达产物。

35、本发明还提供了如前所述融合蛋白的制备方法。所述融合蛋白可以采用基因工程的方法制备，也可以采用化学合成的方法制备。

36、一些实施例中，所述制备方法包括：

37、包括：培养如前所述宿主，获得所述融合蛋白；

38、或包括：将片段a和片段b通过生物和/或化学方法偶联；

39、或包括：通过化学合成法合成如前所述的融合蛋白。

40、所述偶联可选择地包括linker。

41、本发明所述的化学合成法包括固相合成、液相合成、固相-液相结合合成，本发明对此不做限定。

42、本发明所述的融合蛋白可以通过非共价的方式特异性结合到脂肪体表面，从而实现脂肪体的特异靶向。通过该靶向肽段构建的靶向脂肪体可广泛用于精准药物递送、疫苗制备等领域，从而用于癌症、传染病和代谢疾病等疾病的治疗。基于此，本发明还提供了如前所述的融合蛋白在制备靶向性脂肪体中的应用。

43、进一步的，本发明还提供了一种靶向性脂肪体，其制备原料包括：如前所述的融合蛋白、极性脂质与中性脂质。

44、可选择的，极性脂质包括磷脂、功能性极性脂质与阳离子脂质中的一种或多种；

45、所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂与鞘磷脂中的一种或多种；

46、所述功能性极性脂选自聚乙二醇修饰固醇、生物素修饰固醇、氨基酸修饰固醇、多肽修饰固醇、多糖修饰固醇、核酸修饰固醇、聚乙二醇修饰磷脂、生物素修饰磷脂、氨基酸修饰磷脂、多肽修饰磷脂、多糖修饰磷脂与核酸修饰磷脂中的一种或多种；

47、所述阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、2,3-二油酰氧基-n-[2-(精胺甲酰氨基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙胺盐酸盐、1,2-二油酰-sn-甘油-3-[(n-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)与3β-[n-(n',n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐中的一种或多种；

48、所述中性脂质选自甘油三酯、蜡酯、甾醇酯、固醇酯、视黄醇酯与脂溶性微生素中的一种或多种。

49、可选择的，所述制备原料还包括溶剂，所述溶剂包括有机溶剂和缓冲液。所述有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、甲烷、乙腈、吡啶或苯酚。所述缓冲液包括但不限于柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液。

50、本发明所述的靶向性脂肪体可以将具有治疗功能的药物运送到靶标位置，可选择的，所述制备原料还包括药物。本发明中，所述的药物为用以预防、治疗及诊断疾病的物质，包括但不限于防治如下疾病的药物：癌症、传染病、心血管疾病和糖尿病等代谢疾病。

51、此外，还可以加入具有指示功能的标志物，例如，荧光蛋白。

52、更进一步的，本发明还提供了所述的靶向性脂肪体的制备方法，其包括：

53、溶解如前所述的融合蛋白，制得溶液a；

54、溶解极性脂质，制得溶液b；

55、将溶液a和溶液b混合后，经干燥、重新溶解后与中性脂质混合，再离心分离获得含有靶向性脂肪体的产物。

56、本发明实施例中，所述极性脂质与融合蛋白的摩尔比为(100～100000)：(1～10)。一些实施例中，所述极性脂质与融合蛋白的摩尔比为(100～10000)：(1～10)，或为(100～1000)：(1～10)，或为(1000～100000)：(1～10)，或为(10000～100000)：(1～10)，或为100：(1～10)，或为1000：(1～10)，或为10000：(1～10)，或为100000：(1～10)，或为100：1，或为1000：1，或为10000：1，或为100000：1，或为100：2，或为1000：2，或为10000：2，或为100000：2，或为100：3，或为1000：3，或为10000：3，或为100000：3，或为100：4，或为1000：4，或为10000：4，或为100000：4，或为100：5，或为1000：5，或为10000：5，或为100000：5，或为100：6，或为1000：6，或为10000：6，或为100000：6，或为100：7，或为1000：7，或为10000：7，或为100000：7，或为100：8，或为1000：8，或为10000：8，或为100000：8，或为100：9，或为1000：9，或为10000：9，或为100000：9，或为100：10，或为1000：10，或为10000：10，或为100000：10。

57、所述溶液a的溶剂为甲醇和氯仿的混合溶液，其中甲醇和氯仿的体积比为(1～10)：(1～10)。例如，体积比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。溶液a中融合蛋白的浓度为0.1～10mg/ml，例如，浓度为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml。

58、所述溶液b的溶剂为2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱溶液。每80μl溶液b中含有2mg磷脂。所述溶液a与溶液b混合的体积比为1:4。

59、所述重新溶解步骤和/或离心分离步骤的进行可参照申请号为201510974956.6的中国专利。

60、本发明所述靶向性脂肪体的制备方法步骤简单，步骤简洁，不需要复杂仪器，可操作性强。

61、更进一步的，本发明还提供了如前所述靶向性脂肪体或所述制备方法制得的靶向性脂肪体在制备防治疾病的药物或疫苗中的应用。

62、一些实施例中，所述疾病为癌症、病原感染性疾病或者代谢性疾病。所述疾病优选为癌症，所述癌症为：乳腺癌、肺癌、肾癌、喉癌、肝癌、肌肉组织癌症、血癌、骨癌、脑癌、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、膀胱癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、外生殖器癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、泌尿生殖道癌、头癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。

63、更进一步的，本发明还提供了用于防治疾病的药物或疫苗，其包括药学上可接受的辅料和如前所述的靶向性脂肪体或如前所述制备方法制得的靶向性脂肪体。本发明所述的药物或疫苗的剂型为口服制剂、吸入剂或注射剂。

64、可选择的，所述药物或疫苗的为口服制剂，例如，其可为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂或颗粒剂。

65、在本发明提供的一些实施例中，胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。

66、在本发明提供的一些实施例中，片剂为口服片剂或口腔片剂。

67、口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。在本发明提供的一些实施例中，口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。

68、所述药物或疫苗为吸入剂，可选择的，其为吸入气雾剂、吸入粉雾剂和供雾化器使用的液体制剂。

69、所述药物或疫苗为注射剂，例如，其为注射液剂或注射用粉针剂。

70、本发明还提供了一种防治疾病的方法，其包括给予如前所述的药物或疫苗。所述给予的方式包括口服、吸入和/或注射。

71、本发明将靶向识别单分子磷脂膜的多肽片段和靶向识别组织或细胞的多肽片段连接，形成的融合蛋白可以通过非共价的方式特异性结合到脂肪体表面，从而实现脂肪体的精准靶向。通过该脂肪体靶向肽段构建的靶向脂肪体可广泛用于精准药物递送，疫苗制备等领域，从而用于癌症、传染病和代谢疾病等疾病的预防、治疗和诊断。本发明实施例中，作为例子，以肺部组织和乳腺癌细胞为靶点，实现了脂肪体的良好靶向。