一种用于动物受精卵基因编辑的新型CRISPR酶和系统及其应用

本发明属于基因工程，特别涉及一种用于动物受精卵基因编辑的新型crispr酶和系统及其应用。

背景技术：

1、crispr是“clustered regularly interspaced short palindromic repeats”的缩写，是一种存在于细菌和其他生物中的天然防御机制，能够识别和清除外源dna。crispr/cas技术是一种用于编辑基因组的革命性工具。cas(crispr-associated)核酸酶是与crispr结合的蛋白质，具有切割和修复dna的能力。利用crispr/cas技术，可以将crispr系统引导到特定的dna位点，并使用cas蛋白质来精确切割基因组中的dna，从而实现基因组的编辑，包括插入、删除和修改基因序列。

2、目前应用最为广泛的crispr核酸酶是来自化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的spcas9，以及在其基础上进行突变产生的一系列变体。然而，现有的crispr/cas9系统存在一些限制，如特定的宿主物种、靶位点选择以及剪切效率等方面的局限性。通过研发新的核酸酶，可以克服这些限制，并进一步提高crispr技术在基因组编辑中的适用性和可操作性。其次，新型crispr/cas核酸酶的研发将有助于拓宽基因编辑的应用范围。除了crispr/cas9系统外，还有其他类型的crispr系统，如crispr/cas12、crispr/cas13、crispr/c2c2等，它们具有不同的特点和功能。通过研发新的核酸酶，可以扩大基因编辑的目标序列范围，从而更好地适应不同的基因治疗和农业改良需求。此外，新型crispr/cas核酸酶的研发也可以改善crispr技术的安全性。随着crispr技术的广泛应用，对其潜在的风险和伦理问题的关注也在增加。通过研发更具选择性和精确性的核酸酶，可以减少对非目标序列的剪切，从而降低潜在的副作用和安全风险。综上所述，研发新型crispr/cas核酸酶的意义主要体现在提高基因组编辑技术的效率和精确性、拓宽应用范围以及改善技术的安全性，从而促进基因研究和治疗、农业改良等领域的进展。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型crispr酶，用于提高对非人哺乳动物受精卵进行基因编辑的效率，弥补现有基因编辑工具的不足。所述的crispr酶是crispr/cas系统中的效应蛋白，本发明中的crispr酶命名为reqcas9蛋白。

2、本发明的reqcas9蛋白为以下任意一种蛋白：

3、(1)具有如seq id no：1所示的氨基酸序列；

4、(2)在seq id no：1所示氨基酸序列上进行一个或多个氨基酸的置换、缺失、添加，并且基本保留了其源自上述序列的生物学功能。

5、根据cas蛋白的序列比对结果显示，reqcas9蛋白与已报道的cas蛋白具有较低的序列一致性。进一步通过cas蛋白的进化树分析发现，reqcas9蛋白属于cas9蛋白分支，但其蛋白量较大，属于一个相对独立的进化亚分支，可以被视为一种新的cas9蛋白亚分支。

6、一个明显的事实是，有些氨基酸残基的改变并不影响蛋白质的功能活性。因此，对reqcas9蛋白的一些氨基酸残基进行改变，只要这些改变不影响reqcas9蛋白的所需功能和活性，也属于本发明提供的reqcas9蛋白。

7、本发明的reqcas9蛋白生物学功能包括但不限于，与引导rna结合的活性、核酸内切酶活性、在引导rna引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性。

8、同时，本发明还提供了一种融合蛋白，其具有如seq id no：2所示氨基酸序列，所述的融合蛋白包括上述reqcas9蛋白及其其他的修饰部分。具体而言，该融合蛋白通过在其n端和c端添加了多个核定位信号(nls)和蛋白检测标签(ha tag)，增加了其在真核细胞和受精卵中的基因编辑效率。本发明的reqcas9蛋白或其融合蛋白的产生方式并不限于任何特定方法，例如：可以使用基因工程方法，比如重组技术，来产生reqcas9蛋白，也可以使用化学合成方法来生产该蛋白。

9、同时，本发明还提供了一种dna片段，具有seq id nos：3或4所示的序列，具体如下：(1)编码本发明的reqcas9蛋白或融合蛋白的dna序列；(2)与本发明的reqcas9蛋白或融合蛋白的dna序列相比具有一个、多个或全部密码子优化的序列；(3)与(1)(2)任一所述的dna序列互补、反向或反向互补的dna序列。

10、同时，本发明还提供了一种引导rna，具有如seq id no.5所示的序列，所述的引导rna通过seq id no：6所示的dna片段进行编码。

11、该引导rna包括一个骨架区和一个靶向核酸的靶向序列，骨架区也可以称为蛋白质结合区段或蛋白质结合序列，而靶向核酸的靶向序列也可以被称为靶向核酸的靶向区段或靶向靶序列的引导序列。所述引导rna的骨架区能够与本发明的reqcas9蛋白结合形成核酸蛋白复合物，该复合物具有结合靶基因的能力，具有基因编辑的功能。所述靶向核酸的靶向序列或靶向区段含有与目标核酸序列反向互补的核苷酸序列，即该靶向核酸的靶向序列或靶向区段能够通过碱基配对的方式与目标核酸以特异性的方式相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向区段可以被改变或修饰，以适应与目标核酸中的任意所需序列进行杂交。并且，所述的引导rna的骨架区与reqcas9蛋白相互结合，并经过靶向核酸的靶向序列的作用将reqcas9蛋白引导至靶基因上的互补序列，从而进行切割实现基因编辑。

12、同时，本发明还提供了一种质粒载体，其包含有可以表达上述reqcas9蛋白和引导rna的dna序列片段，以及相关的调控序列。质粒载体的调控元件包含但不限于：启动子、终止子、报导基因表达盒、抗性基因表达盒以及载体骨架；所述的质粒载体形式包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体等。

13、同时，本发明还提供了一种工程化的非自然crispr/cas系统，该系统由reqcas9蛋白或编码reqcas9蛋白的dna序列，以及一种或多种引导rna，或编码引导rna的dna序列组成。引导rna包括结合于reqcas9蛋白和靶向靶基因的靶向序列两个部分，其中靶向序列根据靶基因序列的不同是可变化的。值得注意的是，所述的引导rna也可以是化学合成的。所述crispr/cas系统可以与靶基因杂交，可对靶基因序列进行修饰、编辑或切割，由此引起靶基因表达产物的改变。

14、同时，本发明还提供了一种处于激活态的crispr复合物，该复合物包括以下三个组分：

15、(1)蛋白组分，可以选择自本发明的reqcas9蛋白或融合蛋白。

16、(2)核酸组分，即上述的引导rna。

17、(3)靶基因组分，即结合在(2)所述的引导rna上的靶序列。靶基因组分与引导rna的靶向序列形成反向互补，可引发reqcas9蛋白或融合蛋白对靶基因的修饰、编辑或切割。另外，本发明的靶基因与引导rna的靶向序列形成不完全配对的反向互补，也可以引发reqcas9蛋白或融合蛋白对靶基因的修饰、编辑或切割。

18、同时，本发明还提供了一种用于体外培养的工程化的非人哺乳动物受精卵，所述非人哺乳动物受精卵包含本发明所述的reqcas9蛋白、融合蛋白、引导rna、crispr组合物、激活的crispr复合物、载体中的一种或多种。所述的非人哺乳动物受精卵包括但不限于猴、猪、牛、羊、犬、兔、大鼠、小鼠、仓鼠的受精卵。

19、本发明所述的reqcas9蛋白、融合蛋白、引导rna、crispr组合物、激活的crispr复合物、载体、工程化的非人哺乳动物受精卵可用于以下一至多种用途：哺乳动物受精卵的基因编辑、基因靶向、基因切割、基因编辑动物的制备、疾病模型动物或组织构建、动物遗传种质资源的保存与改造。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、1、本发明提供了一类新型的cas核酸酶，与已报道的cas蛋白具有较低的序列一致性，属于一个相对独立的进化亚分支，可以被视为一种新的cas9蛋白亚分支，可在已经证实的多个基因编辑领域进行广泛的应用。

22、2、本发明的reqcas9蛋白量较大，可以与引导rna进行高强度的结合，在非人哺乳动物受精卵中具有较高的基因编辑效率。

23、3、本发明的reqcas9蛋白具有较高的环境耐受性，可以在相对宽松的环境条件下进行使用和保存。