一种脂蛋白相关磷脂酶A2的核酸适配体及用途的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及动脉粥样硬化标志物脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体及其用途。

背景技术：

1、脂蛋白相关磷脂酶a2(lppla2)是一种由许多免疫细胞如：巨噬、单核、肥大和t淋巴细胞产生并分泌的50kd的磷脂酶，又称血小板活化因子乙酰水解酶。lppla2负责水解ldl表面的氧化磷脂，产生促炎副产物模拟血小板活化因子，如溶血磷脂酰胆碱和氧化的非酯化脂肪酸，并吸引单核细胞到该区域，激活白细胞和刺激其他炎症细胞因子(如il-6和tnf-α)的产生来介导炎症反应。lppla2通过吸引平滑肌细胞进入内膜，促进斑块中巨噬细胞的凋亡和坏死，进一步促进动脉粥样硬化。综上所述，lppla2直接参与导致动脉粥样硬化的血管炎症反应，加快易损斑块破裂，进而形成血栓，引发心脑血管恶性事件，是一种新型的、针对血管内皮炎症反应的独立标志物。

2、lppla2作为血管强特异性因子，可成为血管炎症及动脉粥样硬化程度的动态监测指标；并且高水平lppla2预示粥样斑块更加容易破裂，可对心脑血管栓塞性疾病的风险进行评估预警。此外，lppla2生物变异性低，受其他因素和指标影响较小；与传统心血管风险预测指标相比，能直接反映血管内膜的炎症程度；特异性较高、与斑块不稳定性具有更高的关联性。lppla2是fda唯一认可的用于动脉粥样硬化相关的冠心病、缺血性脑卒中及各种血栓性疾病风险评估的血液检测指标。

3、目前检测酶质量的方法有酶联免疫吸附测定(elisa)法、免疫增强比浊法和化学发光法。检测活性的方法为自动生化分析仪的连续检测法。然而，elisa法的流程较为复杂，需要专业的技术人员操作才可尽量避免操作误差，所需检测时间约2h，lppla2的活性检测流程更是需要实验室人员执行并借助大型仪器才可实现。同时，试剂盒所需的两种单克隆抗体和生物酶材料，制备复杂、抗体和酶活性易受温度影响、成本较高，且在国内，两种方法的试剂盒开发尚缺，远远无法满足心脑血管疾病患者的实际检测需求。因此，研发新型的lppla2检测试剂盒用于预警心血管恶性事件，在居家监测和临床检验中具有广阔的应用前景。

4、核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配体系统进化技术(selex)筛选的具有靶向作用的核酸序列。它可折叠成特定的三级结构，通过氢键、静电相互作用、疏水作用、芳环堆积和范德华力等作用与包括蛋白质、小分子、病毒、细菌、细胞等靶标结合，在疾病诊断、靶向给药、环境监测和食品安全分析方面发挥重要作用。因此如果能找到与lppla2具有更高的亲和力，并且具有高特异性的核酸适配体，将有助于实现lppla2的高灵敏度和高特异性检测。

技术实现思路

1、鉴于现有方法只可实现在实验室条件下的检测，需消耗较高的时间、试剂、人力成本，本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶a2的适配体及其应用，所述适配体与脂蛋白相关磷脂酶a2具有极强的亲和力和特异性，可用于高效检测脂蛋白相关磷脂酶a2。

2、相应地，本发明还提供一种脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体作为检测脂蛋白相关磷脂酶a2探针、在比色检测法中的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

4、第一方面，本发明提供所述脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体的筛选方法。采用磁珠法固定靶标蛋白进行lppla2筛选，进行8轮正筛并在第2轮和第6轮添加磁珠-血清蛋白反筛。在capture-selex筛选方法的基础上，采用两种带有相同引物但不同长度随机序列(40nt和50nt)的dna文库，以增加其筛选结合概率。在磁珠法筛选的8轮循环中，在第2轮和第6轮正筛前，通过添加人血清固定化的磁珠(其中含有的多种蛋白)进行负筛，将非特异性结合的序列除去作为第2和6轮的正筛文库，进一步提高核酸适配体的特异性，可更好的满足后期基于核酸适配体开发应用的实际血清检测环境。

5、第二方面，本发明筛选获得一组脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体，经流式细胞仪和表面等离子体共振实验验证，其3条核苷酸序列b76-2、b76-4及b76-5对lppla2具有较优秀的亲和力和特异性，如表1所示核苷酸序列seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3，方向均为5’-3’。

6、表1.筛选获得一组脂蛋白相关磷脂酶a2的适配体序列

7、

8、本发明所述的脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体，可为核酸适配体b76-2、b76-4、b76-5中的至少一种。

9、所述核酸适配体b76-2、b76-4、b76-5中的至少一种，其核苷酸序列包括两端的18nt的固定引物区和中间40nt的随机序列区，其中引物区的倾斜字体部分为10bp的互补序列，核酸适配体b76-2、b76-4、b76-5的序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示。

10、所述的核酸适配体，在25℃，100mm na+，10um mg2+的条件下，所述核酸适配体b76-2、b76-4、b76-5的空间结构分别如下：

11、

12、对所述核酸适配体b76-2、b76-4、b76-5中的至少一种的5’端或3’端进行荧光基团、氨基、生物素、地高辛或聚乙二醇化学修饰。

13、第三方面，本发明提供了所述的脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体在制备检测脂蛋白相关磷脂酶a2的试剂、试剂盒或传感器中的应用。

14、所述的脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体在制备检测脂蛋白相关磷脂酶a2分子探针中的应用。一种分子探针，包含所述的核酸适配体。

15、一种特异性识别脂蛋白相关磷脂酶a2的试剂盒，它包含所述的核酸适配体与纳米金的复合物。

16、所述的脂蛋白相关磷脂酶a2的核酸适配体在纳米金比色检测法检测脂蛋白相关磷脂酶a2中的应用。

17、方法原理：基于纳米金聚集变色性质以紫外分光光度计评估血清中动脉粥样硬化的生物标志物lppla2浓度。图9展示了检测方法的整个过程，包括：首先，采用静电吸附使aunp与适配体b76-2结合，通过加入靶标lppla2诱导适配体探针构象转变而从aunps表面解离，在60mm高盐浓度下发生聚集，以纳米金的波峰右移进行测定。通过显色反应和吸光性变化，实现在生理和病理水平检测lppla2标志物。

18、较之现有技术而言，本发明的优点在于：

19、本发明提供的一组脂蛋白相关磷脂酶a2适配体，其弥补了脂蛋白相关磷脂酶a2适配体领域的空白，且具有较高的亲和力和特异性。其中筛选验证了3条对脂蛋白相关磷脂酶a2具有良好亲和力和特异性的适配体；其可制成分子探针、作为检测试剂等在检测脂蛋白相关磷脂酶a2的方法或相应的试剂盒中应用，提高准确率。

20、其中，本发明提供的筛选方法简便可靠，本发明提供的3条脂蛋白相关磷脂酶a2适配体，具有与抗体相似的亲和力和特异性，可人工合成，成本低、易于化学修饰；

21、本发明所提供的基于纳米金-适配体作为比色检测方法简单、可视化、成本低，在恶性心血管疾病的预警方面具有巨大应用潜力。