一种油黄口蘑多糖及其制备方法和应用

本发明涉及真菌多糖应用，特别涉及一种油黄多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

1、食用菌俗称蘑菇，是一种大型真菌，其子实体中富含蛋白质、维生素、矿质元素、氨基酸以及多糖等营养物质。食用菌多糖具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、促进免疫细胞的增殖分化和淋巴因子的分泌、激活补体等免疫调节等生物活性等特点，安全无毒，其在保健食品和生物医药等领域受到广泛的关注。而且食用菌多糖是一种非特异性免疫增强剂，它可通过多种途径提高机体免疫功能，而对机体没有副作用。

2、油黄口蘑(tricholoma flavovirens)又名荞面菌、黄荞面菌、黄丝菌、油蘑、马口蘑、黄白蘑、荞面蘑、黄茅草以及松毛菇等，隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、口蘑属，其味道鲜美，营养丰富，属优良食菌。油黄口蘑的子实体黄色，菌盖宽5-10cm，扁半球形至平展，顶部稍凸起，淡黄色、柠檬黄色，具褐色鳞片，粘，边缘平滑易开裂。菌肉白色至带淡黄色，稍厚。菌褶淡黄色至柠檬黄色，稍密，弯生，不等长，边缘锯齿状。菌柄长4.5-7cm，粗0.8-2cm，圆柱形，淡黄色，具纤毛状小鳞片，内实至松软，基部稍膨大。孢子印白色。孢子无色，光滑，卵圆形至宽椭圆形，6-7.5μm×4-5μm。

3、张水花等在《微波辅助提取油黄口蘑多糖工艺及其体外抗氧化性研究》(北方园艺，2018，419(20):120-124.)报道了液料比、微波功率、微波时间、提取次数对云南野生油黄口蘑子实体多糖提取率的影响,在单因素试验基础上,采用正交实验优化了工艺条件,对最佳工艺条件下提取产物进行了dpph、abts+清除研究。结果表明，对油黄口蘑多糖提取率影响最大的是微波时间,其次是液料比,提取次数影响最小；优化工艺条件为液料比15:1ml/g,微波功率320w,微波时间3min,提取3次,在此条件下多糖提取率达4.11％。抗氧化性研究表明,多糖具有良好的抗氧化能力。在一定浓度范围内,清除能力与浓度呈正相关,当多糖浓度分别为3.5、2.5g/l时对dpph·及abts+·的清除率分别达到88％和90％。

4、pessoa等在《action of bioactive compounds in cellular oxidativeresponse.》(energy reports,2020,6(1):891-896.)报道了从油黄口蘑子实体中分离到的多糖具有抗氧化的特性。

5、可见，现有技术中缺少对油黄口蘑多糖的精细结构、油黄口蘑多糖在免疫调节活性中应用的研究。

技术实现思路

1、本发明克服了现有技术中存在的缺陷，提供了一种油黄口蘑多糖及其制备方法和应用。

2、本发明的第一方面提供了一种油黄口蘑多糖(tf-p)，其为由葡萄糖和阿拉伯糖组成的杂多糖，其中葡萄糖和阿拉伯糖残基的摩尔比为7:3。

3、进一步地，所述多糖的化学结构中包含1,4-连接的葡萄糖残基和1,4-连接的阿拉伯糖残基。

4、进一步地，所述多糖的重均分子量为10000-20000da(如10000da、11000da、12000da、13000da、14000da、15000da、15010da、15020da、15030da、15040da、15050da、15060da、15070da、15080da、15090da、16000da、17000da、18000da、19000da、20000da)，优选地，为12000-18000da，进一步优选地，为13000-17000da。

5、在本发明的一个实施例中，所述多糖的重均分子量为15075da。

6、进一步地，上述多糖包含如下结构式：

7、

8、其中，n为1-20的整数(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)，优选地，为2-15的整数，更优选地，为3-10的整数。

9、其中，glcp为葡萄糖，arap为阿拉伯糖。

10、本发明的第二方面提供了一种组合物，所述组合物包含第一方面所述的多糖。

11、本发明的第三方面提供了一种如第一方面所述的油黄口蘑多糖的制备方法，所述制备方法包括以油黄口蘑子实体为原料进行提取的步骤。

12、进一步优选地，所述制备方法包括通过水提醇沉法提取得到粗多糖的步骤。

13、进一步优选地，所述制备方法还包括(例如通过离子交换柱层析)对粗多糖进行纯化的步骤。

14、在本发明的一个实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：

15、(1)取油黄口蘑子实体粉末，用热水浸提，将所得水提物依次经浓缩、醇沉、烘干得到粗多糖；

16、(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；

17、(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋进行透析浓缩。

18、进一步地，所述制备方法还包括步骤(4)，具体为将完成步骤(3)后的透析袋内液体冷冻干燥。

19、进一步地，步骤(1)中，所述浸提的温度可以为80-100℃(如80、85、90、95、100℃)；在本发明的一个实施例中，该浸提温度为98℃。

20、进一步地，步骤(1)中，油黄口蘑子实体粉末与水的质量比(w/v，mg/ml)为1:1-10(如1:1、1:2、1:3、1:5、1:8、1:10)；在本发明的一个实施例中，该质量比为1:3。

21、进一步地，步骤(1)中，所述浸提的次数为1-5次(如1、2、3、4、5次)；在本发明的一个实施例中，该浸提次数为3次。

22、进一步地，步骤(1)中，每次浸提时间为1-10小时(如1、3、6、8、10小时)；在本发明的一个实施例中，每次浸提时间为6小时。

23、在本发明的一个实施例中，步骤(1)中的浸提步骤可以包括：取油黄口蘑子实体粉末，与水混合，并置于水浴中煮沸。

24、进一步地，步骤(1)中，醇沉步骤中，醇与水提物浓缩液的体积比为1-10:1(如1:1、3:1、4:1、5:1、10:1)；在本发明的一个实施例中，该体积比为3:1；

25、在本发明的一个实施例中，上述醇沉步骤中，醇为乙醇。

26、在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：取油黄口蘑子实体粉末，热水浸提，收集上清液，浓缩，加入无水乙醇，收集沉淀，烘干，除去其中蛋白质，得到粗多糖。

27、进一步地，步骤(2)中，离子交换柱可以为纤维素柱，该纤维素柱的填料如deae纤维素。

28、进一步地，步骤(2)中，洗脱所用洗脱剂可以为nacl溶液；具体地，该nacl溶液浓度为0.01-1.0mol/l(如0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0)mol/l。

29、进一步地，步骤(2)中，洗脱可以为梯度洗脱，洗脱剂浓度可以为0.01-1.0mol/l(如0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0)mol/l。

30、在本发明的一个实施方式中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得粗多糖的水溶液通过纤维素柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。

31、进一步地，步骤(3)中，透析袋的截留分子量为5000-10000da(如5000、6000、7000、8000、9000、10000da)；在本发明的一个实施例中，该截留分子量为7000da。

32、在本发明的一个实施例中，步骤(3)包括：将步骤(2)所得洗脱液置于透析袋中进行透析，透析两天。

33、本发明的第四方面提供了一种如第一方面所述的油黄口蘑多糖或如第二方面所述的组合物或如第三方面所述制备方法制备得到的粗多糖的应用，所述的应用包括：

34、(1)在制备能够增强免疫力的产品中的应用；

35、(2)在制备具有抗肿瘤活性的产品中的应用。

36、进一步地，所述产品为食品、保健品或药品。

37、进一步地，所述应用中，所述多糖可单独使用，可也与其他活性成分联合使用。

38、进一步地，所述产品中油黄口蘑多糖的浓度为0.5-25μg/ml(如0.5μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、25μg/ml)，优选为0.6-20μg/ml。

39、进一步地，当为提升raw 264.7和免疫t细胞的增殖效果时，油黄口蘑多糖的浓度优选为20μg/ml；当为提升免疫b细胞的增殖效果时，油黄口蘑多糖的浓度优选为5μg/ml。

40、进一步地，当为提升mfc和llc细胞的抑制效果时，油黄口蘑多糖的浓度优选为10μg/ml；当为提升ct26.wt细胞的抑制效果时，油黄口蘑多糖的浓度优选为1.25μg/ml。

41、本发明的有益效果是：

42、本发明自油黄口蘑分离纯化得到多糖tf-p，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的免疫调节活性，特别在5μg/ml浓度时，b细胞的增殖率最高；特别在20μg/ml浓度时，t细胞和raw264.7细胞促增殖率最高。该多糖还具有显著的抗肿瘤活性，特别在1.25μg/ml浓度时，ct26.wt细胞的增殖率最高；特别在10μg/ml浓度时，mfc细胞和llc细胞抑制率最高。