含sn-1,3定向脂肪酶的融合蛋白及其全程可视化制备方法和应用

本发明属于酶工程，具体涉及一种含sn-1,3定向脂肪酶的融合蛋白及其全程可视化制备方法和应用。

背景技术：

1、sn-1,3定向脂肪酶是专一性脂肪酶，主要来源于动物胰脏和微生物，能够优先水解甘油三酯1,3位的脂肪酸而生产游离脂肪酸和2位甘油单酯等，可以用于食品工业中合成结构性脂质，如1,3-油酸-2-棕榈酸-三酰甘油(opo)、甘油二酯(dag)等，还可以用于手性药物中间体合成及某些生物材料的制备等。

2、近年来，研究表明母乳中甘油三酯中脂肪酸的位置对婴儿营养吸收有着重要影响。母乳中含有3％-4.5％的脂肪，其中98％为甘油三酯，母乳中的甘油三酯主要是opo，在体内经脂肪酶消化后棕榈酸以sn-2位甘油单酯的形式被吸收，不易形成钙皂，防止婴儿便秘，不影响钙吸收。因此，opo被广泛用于婴儿食品。目前制备opo的主要方法是通过三棕榈甘油酯与油酸乙酯在sn-1,3定向脂肪酶的作用下反应生成opo，或者是以大豆油、菜籽油和乳脂为原料在sn-1,3定向脂肪酶的作用下生成opo。与此同时，sn-1,3定向脂肪酶也被广泛应用于dag的合成。dag是由甘油和两个脂肪酸酯化后得到的，具有安全、营养、加工适应性好、人体相容性高等优点，是一种多功能添加剂。研究表明，1,3-dag有降低人体血清甘油三酯，减少肝脏、腹部脂肪堆积的功能，能够预防和治疗高血脂症以及其他血脂异常的疾病。目前，主要的dag制备方法是在高温高压的条件下提取大豆油或者菜籽油中的脂肪酸，再在sn-1,3定向脂肪酶的作用下与甘油合成dag。

3、虽然sn-1,3定向脂肪酶在功能性脂质的制备过程中具有重要的作用，但是其应用研究还停留在实验室阶段，工业化应用并不多，这是因为sn-1,3定向脂肪酶的价格昂贵，催化效率低。目前文献中使用的sn-1,3定向脂肪酶主要是诺维信公司的lipozyme rm im和lipozyme tl im。lipozyme rm im和lipozyme tl im分别来源于米黑根毛霉(rhizomucormiehei)和疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)，具有很强的sn-1,3定向脂肪酶活性。由于野生菌株的脂肪酶产量低，提取困难，诺维信公司采用米曲霉成功实现了这两个基因的重组表达，获得了液体酶20000l，固定化酶lipozyme rm im和lipozymetl im等产品。然而，由于这两种sn-1,3定向脂肪酶都是通过米曲霉重组表达的，故产品中含有大量的米曲霉内源蛋白，严重影响了产品的应用，虽然可以通过纯化优化，但是也增加了酶的生产成本。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提供一种含sn-1,3定向脂肪酶的融合蛋白，该融合蛋白可于大肠杆菌中分泌表达，且便于固定纯化，其活性与市售的定向脂肪酶相当，工业应用潜力大。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体为：

3、本发明第一方面提供了一种含sn-1,3定向脂肪酶的融合蛋白，该融合蛋白由sn-1,3定向脂肪酶与超折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)突变体通过连接肽构建而成，其中，sfgfp突变体净带负电荷，且sfgfp突变体融合表达在sn-1,3定向脂肪酶的c端(即羧基端)，连接肽则由2～10个酸性氨基酸组成。

4、本发明将sn-1,3定向脂肪酶与净带负电荷的sfgfp突变体进行融合表达，通过融合净带负电荷的sfgfp突变体和添加酸性氨基酸降低融合蛋白等电点的方法，一方面促进了目的蛋白分泌到培养上清中，另一方面利用融合蛋白带有大量负电荷的特点，简化后续固定纯化操作；而且，融合蛋白中的连接肽可进一步提高酶活和固定化效率。

5、优选地，在上述融合蛋白中，所述sfgfp突变体为净带15个负电荷的sfgfp突变体，记作sfgfp(-15)，且其氨基酸序列如seq id no.6所示。

6、优选地，在上述融合蛋白中，所述sn-1,3定向脂肪酶为如下a)或b)：

7、a)来源于米黑根毛霉的脂肪酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示；

8、b)来源于疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶，氨基酸序列如seq id no.4所示。

9、需要说明的是，本发明所述融合蛋白中的sn-1,3定向脂肪酶包括但不限于上述来源于米黑根毛霉和疏棉状嗜热丝孢菌的两种脂肪酶，只要sn-1,3定向脂肪酶在本发明所述融合蛋白的结构中，仍具有脂肪酶活性即可。

10、优选地，在上述融合蛋白中，所述酸性氨基酸为天冬氨酸(asp,d)和谷氨酸(glu,e)，且连接肽为(de)n，其中n为1或2或3或4或5。

11、本发明第二方面提供了一种编码本发明所述融合蛋白的基因，该基因包括：编码净带负电荷的sfgfp突变体的核苷酸序列，编码sn-1,3定向脂肪酶的核苷酸序列，以及编码连接肽的核苷酸序列。

12、优选地，在上述基因中，编码sfgfp突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示。

13、优选地，在上述基因中，编码sn-1,3定向脂肪酶的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.3所示。

14、优选地，在上述基因中，编码连接肽的核苷酸序列为(gaagat)n。

15、本发明第三方面提供了一种重组载体，该重组载体中含有编码本发明所述融合蛋白的基因。

16、本发明第四方面提供了一种基因工程菌株，该菌株通过将本发明所述重组载体转化至大肠杆菌所得。

17、本发明第五方面提供了本发明所述基因、重组载体、基因工程菌株在制备融合蛋白中的应用。

18、本发明第六方面提供了一种制备本发明所述融合蛋白的全程可视化方法，具体包含以下步骤：

19、s1、构建超折叠绿色荧光蛋白与sn-1,3定向脂肪酶融合表达的重组载体；

20、s2、将重组载体转化至大肠杆菌，获得表达菌株；

21、s3、培养表达菌株获得种子液，再将种子液接种至发酵罐中发酵，从发酵上清液即可获取融合蛋白。

22、优选地，在上述方法中，还包括以下步骤：

23、s4、将预处理后的阴离子交换树脂与浓缩的发酵上清混合，低温吸附，抽滤后干燥。

24、在本发明的一些实施例中，所述阴离子交换树脂的预处理方法为：①将树脂用95％乙醇浸泡24h，水洗至滤液不呈白色浑浊；②5％ hcl浸泡2h，水洗至滤液呈中性；③2％的naoh溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性。

25、本发明第七方面提供了一种固定化酶，该固定化酶包括阴离子交换树脂和本发明所述的融合蛋白。

26、本发明第八方面提供了本发明所述的融合蛋白、固定化酶在甘油二酯合成中的应用。

27、本发明的有益效果为：

28、(1)本发明发现将净带负电荷的sfgfp突变体融合在sn-1,3脂肪酶的c端时，能够起到促进重组蛋白分泌表达的功能；同时，本发明发现在净带负电荷的sfgfp突变体与sn-1,3脂肪酶之间引入酸性氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸等，能够进一步降低融合蛋白等电点的方法，促进目的蛋白分泌到培养上清中。

29、(2)利用本发明方法制备的重组蛋白，无需纯化，而且由于融合蛋白带有大量负电荷，故可以直接使用廉价的阴离子交换树脂通过静电吸附的方式从培养上清中进行固定化，可见本发明建立了一种sn-1,3定向脂肪酶的高效分泌表达和固定化技术，解决了现有技术中sn-1,3定向脂肪酶重组表达产量低、纯化工艺复杂等问题。

30、(3)在本发明的方案中，由于融合的sfgfp突变体产生绿色荧光，因此从重组蛋白的发酵制备到固定化，再到使用的过程中均可通过肉眼观察到酶的状态，为该酶的使用提供了方便。