基于RPA-CRISPR/Cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法

本发明属于山药病原真菌的田间快速实时可视化检测，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法。

背景技术：

1、山药（ dioscorea opposita），又名薯蓣，隶属于薯蓣科薯蓣属草本植物，其在国内外均有分布。山药具有重要的食用与药用价值，在我国多地均有种植，并有诸多具有地方特色的山药品种。然而山药在种植过程多采用地下茎段、零余子等营养器官进行繁殖，长此以往，其遗传背景多样性降低，易受到病原真菌-链格孢菌（ alternaria alternata）的侵染。在山药中，链格孢菌以侵染山药叶片为主，在叶片中常表现为黑色斑块，造成山药叶片枯死，严重影响叶片的光合作用，如不及时控制链格孢菌的传播，将最终导致山药整体植株的死亡。山药叶片出现黑斑、枯斑可能是由于物理因素或其它生物因素（如昆虫）造成，因而需要加强对链格孢菌的检测，这对于及时有效地开展山药黑斑病的防治工作至关重要。

2、当前，针对植物病原真菌的检测方式已有部分报道，较为常用的有直接观察法、分离培养并联合生物学特征测定法、显微镜观察法以及分子生物学技术（彭丹丹,张源明,舒灿伟,等.植物病原真菌分子检测技术的研究进展[j].基因组学与应用生物学,2017,36(05):2015-2022）。其中，直接观察法是通过观察植物染病后所表现出的症状来推断植物是否符合某一真菌病害的特征来判断。显微镜观察法、分离培养并联合生物学特征测定法主要是通过分离纯化植物病灶处的真菌微生物，通过观察菌落形态、显微镜下菌丝及孢子特征、部分生理指标的测定来确定真菌的种类。上述方法在检测上主要体现出以下不足：鉴定病原菌过程复杂，要先通过分离纯化到病原菌，才能进行后续的特征观察与指标测定；易出现误诊，部分真菌经人工分离培养后，可能会出现菌落形态变化，一些真菌感染植物初期，可能会被其它环境因素干扰，造成症状表现不明显。近年来，分子生物学方法（主要是pcr及其衍生技术）由于其高灵敏度、高特异性、检测结果可靠的特点，被广泛运用到病原菌的检测中。但该方法需要制备样本的核酸（当前核酸提取多使用成品试剂盒与低温高速离心机等）、借助精密设备（如pcr仪、qpcr仪）进行基因扩增并需借助凝胶电泳等进行分析，使得针对病原真菌在简易环境（如非实验室环境）下很难开展相应的核酸检测。因此，开发一种快速地适用于在非实验室环境下可视化检测的方法就显得十分重要（jiao j, kong k, hanj. et al. field detection of multiple rna viruses/viroids in apple using acrispr/cas12a‐based visual assay[j].  plant biotechnology journal, 2021,19,394-405）。

3、rpa-crispr/cas12a技术在近年来被广泛应用于特定核酸片段的扩增和检测中，其原理为rpa能够在37 ℃下快速扩增出待检测的核酸片段以达到crispr/cas12a的检测最低限度。此时当携带有特异crrna（crispr/rna）的cas12a与病原体核酸片段（经rpa扩增）特异性结合形成crrna-dna-cas12a三元复合物时，cas12a的ruvc酶切位点激活后会发挥其非特异性核酸酶活性（zetsche b, gootenberg js, abudayyeh oo.et al. cpf1 is asingle rna-guided endonuclease of a class 2 crispr-cas system[j].  cell, 2015,163 (3):759-771）（chen j, ma e, lucas b.  et al. crispr-cas12a target bindingunleashes indiscriminate single-stranded dnase activity[j].  science, 2018,360(6387)），该状态下的cas12a能够酶切体系中添加的非特异性荧光探针（ssdna reporter）继而释放出荧光信号，该荧光信号既能够及时被qpcr仪捕获，也能够在紫外线/蓝光/可见光下直接用肉眼观察到，可以用来检测特定核酸片段的存在（ding x, yin k, li z. etal. ultrasensitive and visual detection of sars-cov-2 using all-in-one dualcrispr-cas12a assay.  nature communication, 2020 (11), 4711）（wang x, zhong m,liu y. et al. rapid and sensitive detection of covid-19 using crispr/cas12a-based detection with naked eye readout, crispr/cas12a-ner[j].  science  bulletin, 2020, 65(17)）。

4、当前，rpa-crispr/cas12a检测体系已用于马铃薯y病毒（何雨龙,王佳歌,赵珊珊,等.马铃薯y病毒rpa-crispr/cas12a检测技术体系的建立与应用[j].植物学报, 2022, 57(3): 308-319）、新冠病毒（ding x, yin k, li z. et al. ultrasensitive and visualdetection of sars-cov-2 using all-in-one dual crispr-cas12a assay.  nature  communication, 2020 (11), 4711）、转基因作物（wang jb, wang y, hu xw.  et al. thedevelopment of rpa and crispr-cas12a based immunoassay strip for sensitivedetection of genetically modified crops[j].  food control, 2022）等检测中，但在诊断山药黑斑病病原真菌（链格孢菌）的检测上还未见相关报道。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供了一种基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，该检测方法无需复杂的大型实验室仪器、实时迅速、并以可视化形式观察测试结果，能够在实验室与非实验室环境（如田间）实现山药黑斑病病原真菌-链格孢菌的快速特异性检测。

2、本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体过程为：以链格孢菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药新鲜叶片为材料进行dna粗提取制得dna粗制提取液，再将dna粗制提取液加入到rpa扩增体系进行扩增反应，扩增反应结束后将rpa扩增产物加入到crispr/cas12a反应体系中进行反应，再将其置于蓝光led灯下照射进行检测，发出蓝绿光为阳性结果，无发光为阴性结果；

3、所述rpa扩增体系中rpa引物序列为：

4、 al-rf 5’-ccttaaagtaattggcagccggcctactggtttc-3’；

5、 al-rr 5’-ggcttaatggatgctagacctttgctgatagaga-3’；

6、所述crispr/cas12a反应体系的组成为：

7、nebuffer4 2 μl、crrna 0.025 μmol·l-1、cas12a重组蛋白0.05 μmol·l-1、rnase inhibitor 10 u、荧光探针4 μmol·l-1，rnase free ddh2o补至17 μl，将混合组分置于37 ℃加热5 min，促进crrna与cas12a形成二元复合物即形成crispr/cas12a反应体系；

8、其中crrna的全长核苷酸序列为：

9、5’-uaauuucuacuaaguguagaucggagcgcagcacaagucgcacu-3’；

10、荧光探针选用 taqman探针，该荧光探针序列为5’-fam-ttatt-bhq-3’。

11、本发明所述基于rpa-crispr/cas12a的山药黑斑病病原菌的快速特异性检测方法，其特征在于具体步骤为：

12、步骤s1：于田间选取表现出黑斑病症状的山药叶片，进行常规真菌分离与培养；

13、步骤s2：步骤s1中pda培养基培养出黑色真菌菌落时，选取部分真菌菌丝，在液氮环境中将菌丝研磨成粉，利用ctab法进行真菌dna提取；

14、步骤s3：以步骤s2中提取的dna作为扩增模板，真菌通用its区扩增引物进行pcr扩增反应，并将所得的pcr扩增反应产物使用1.5wt%琼脂糖凝胶电泳进行目的条带分离与检测，使用fastpure gel dna extraction mini kit（vazyme）进行目的条带回收，并通过拓扑克隆载体试剂盒5min ta/blunt-zero cloning kit（vazyme）将携带目的条带的载体导入到感受态细胞fast t1（vazyme）中，待筛选平板长出阳性菌落后，挑取单菌落进行常规一代测序；

15、步骤s4：将步骤s3菌落的测序结果置入ncbi数据库的blast工具进行比对，确定分离培养的真菌为链格孢菌，再针对链格孢菌its区特异位点，设计rpa引物，并在rpa扩增目的片段内，围绕cas12a的pam位点设计针对链格孢菌的不同crrna引物序列，分别命名为al-crrna1~crrna5，荧光探针序列以及两端修饰的化学基团为5’-fam-ttatt-bhq1-3’，以步骤s3中得到的克隆载体作为检测对象，进行crispr/cas12a反应，筛选最优crrna；

16、步骤s5：以步骤s3中获得的携带有链格孢菌its区克隆载体为扩增模板，步骤s4中设计与合成的rpa引物，参照rpa试剂盒（twist dx）指示步骤进行rpa扩增；

17、步骤s6：以步骤s4中筛选的最优crrna和设计的 taqman探针以及经自行优化后的crispr/cas12a检测需要的其它试剂组分组成crispr/cas12a反应体系，来检测步骤s5中的rpa扩增反应产物，观察反应体系是否产生蓝绿色发光；

18、步骤s7：以培养的链格孢菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药叶片为材料进行dna粗提取制得待检样本dna粗制提取液；

19、步骤s8：吸取s7制得的待检样本dna粗制提取液直接加入到rpa扩增体系进行扩增反应，扩增反应结束后将rpa扩增产物加入到crispr/cas12a反应体系内进行反应，再将其置于蓝光led灯下照射进行检测，发出蓝绿色光为阳性结果，无发光为阴性结果。

20、进一步限定，步骤s1中真菌分离与纯化的过程为：摘取山药染病叶片样本保持湿润带回实验室，于无菌的超净工作台中，使用体积分数为75%酒精对叶片消毒30 s后置于3vol% naclo溶液中消毒3 min，消毒结束后，使用无菌蒸馏水冲洗3~5次；在灭菌的培养皿中，使用刀片切取叶片中的患病组织，并将组织叶片接种于pda培养基中，将其放置于28 ℃培养箱中培养。

21、进一步限定，步骤s2中真菌dna提取的过程为：将菌丝研磨得到的粉末加入到ctab提取缓冲液中，该ctab提取缓冲液的组成为2wt% ctab、100 mmol·l-1 tris-hcl、20mmol·l-1 edta、1.4 mol·l-1 nacl和2vol% β-巯基乙醇，ph 8.0，振荡混匀后，置于65 ℃水浴加热40 min，期间需颠倒混匀，加热混匀后，转速12000 r/min离心10 min，吸取上清于1.5 ml离心管中，再加入等体积的氯仿，颠倒混匀，转速12000 r/min离心10 min，吸取上清，再加入等体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃静置20 min，再于室温转速12000 r/min，离心10 min，弃上清，使用体积分数75%乙醇洗涤沉淀2次，最后使用ddh2o溶解沉淀。

22、进一步限定，步骤s3中真菌通用its区扩增引物以及pcr反应的过程为：真菌通用its区扩增引物，its1：tccgtaggtgaacctgcgg，its4：tcctccgcttattgatatgc；pcr反应使用2×es  taq mastermix（cwbio）试剂盒，扩增反应程序为预变性95 ℃ 3 min，循环反应95 ℃30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，终延伸5 min，循环数设定为35。

23、进一步限定，步骤s4中rpa引物序列的具体制备过程为：

24、（1）依据实际测序结果，结合ncbi数据库中已有的链格孢菌核酸序列，利用genious8.0软件设计rpa引物；

25、（2）选取上述rpa区段中的cas12a靶点，在其内挑选cas12a核酸酶识别的protospacer adjacent motif（pam）位点，其具体设计过程为：在给定的核酸序列两条链中寻找5’-tttn-3’序列后，以其作为non-target sequence链，以5’-tttn-3’序列中分别以第1个t、第2个t、第3个t、第4个碱基n以及自pam位点后的第1个碱基为初始碱基，向3’方向延伸24个碱基，将其内的胸腺嘧啶（t）替换为尿嘧啶（u），即为crrna的序列，并在crrna的5’端添加茎环结构，通过观察和比较各crrna参与反应的荧光值筛选最优的crrna，各crrna全长核苷酸序列分别为：

26、 al crrna1 5’-uaauu ucuac uaagu guaga ggagc gcagc acaag ucgca cucu-3’

27、 al crrna2 5’-uaauu ucuac uaagu guaga cggag cgcag cacaa gucgc acuc-3’

28、 al crrna3 5’-uaauu ucuac uaagu guaga ucgga gcgca gcaca agucg cacu-3’

29、 al crrna4 5’-uaauu ucuac uaagu guaga uucgg agcgc agcac aaguc gcac-3’

30、 al crrna5 5’-uaauu ucuac uaagu guaga uuucg gagcg cagca caagu cgca-3’。

31、进一步限定，步骤s5中rpa扩增反应的具体过程为：twistamp basic kits试剂盒（twist dx）中rehydration buffer 29.5 μl，rpa上下游引物各2.4 μl，rpa上下游引物的母液浓度为10 μmol·l-1，magnesium acetate 5 μl，magnesium acetate母液浓度280mmol·l-1， a twistamp basic reaction固体粉状试剂1枚，链格孢菌dna 2 μl，用ddh2o将终体积添加到50 μl，添加完上述组分后，将反应体系振荡混匀，37 ℃孵育5 min，第5 min时，再次振荡混匀反应体系，继续37 ℃孵育至30 min。

32、进一步限定，步骤s6中检测的具体过程为：crispr/cas12a反应体系的各组分及配比经过自行优化，具体依照如下条件进行配制，nebuffer4 2 μl、crrna 0.025 μmol·l-1、cas12a重组蛋白0.05 μmol·l-1、rnase inhibitor 10 u和荧光探针4 μmol·l-1，rnasefree ddh2o补至17 μl，将混合组分置于37 ℃加热5 min，促进crrna与cas12a形成二元复合物即形成crispr/cas12a反应体系，再将3 μl步骤s5中的rpa扩增反应产物加入到crispr/cas12a反应体系中，将反应体系置于蓝光led灯下照射，发出蓝绿色光为阳性结果，无发光为阴性结果。

33、进一步限定，步骤s7中样本dna粗制提取液的制备过程为：取20~40 mg pda培养基培养的真菌菌落或疑似感染链格孢菌的山药叶片鲜样，加入到含有350 μl的dna粗制提取液的1.5 ml离心管中，手动匀浆，于室温静置5 min，所获上清液体中即含有dna；所述dna粗制提取液的组分为0.5 mol·l-1naoh、100 mmol·l-1 tris-hcl和1 mmol·l-1 edta，溶剂为rnase free ddh2o。

34、采用本发明检测山药黑斑病病原真菌的技术方案产生的优点和有益效果为：

35、1、检测所需时间短，该检测方法自样本采集至观察结果耗时60 min左右，常规pcr检测技术至少需要3 h，时间约为传统检测方法的1/3；

36、2、便于操作，该方法需要用到分子生物学的吸头、离心管等常规耗材，仅需微量移液器进行移液操作和借助便携式的蓝光灯进行观察，无需pcr仪、凝胶分析等复杂的设备仪器；

37、3、该方法涉及到的反应温度为37 ℃，可依托检验人员的体温或盛装有37 ℃温水的保温杯等简易条件进行加热，无需复杂的变温过程，减少能耗、降低经济成本。