一种基于转录组测序的基因定位的方法

本发明涉及生物，特别涉及一种基于转录组测序的基因定位的方法。

背景技术：

1、目前，寻找控制目标性状基因的方法有很多种，如利用连锁图谱关联定位、混合分组分析、关联分析等正向遗传学的方法，也可以利用反向遗传学来挖掘基因，如rna-seq等可利用差异表达基因分析来筛选鉴定候选基因等。利用正向遗传学的方法往往需要根据初步定位的结果进一步进行精细定位，结合区间内功能基因注释筛选候选基因，但往往需要构建稳定的遗传群体，或者需要筛选大量的群体寻找重组单株不断缩小目标区间来锁定候选基因，因此一般具有耗时长、工作量大的特点。利用反向遗传学可以快速挖掘候选基因，但结果有时没有正向遗传学的方法可靠，尤其是目的基因是当前功能注释信息较少的基因。利用正遗传学和反向遗传学相结合的方法往往也等得到较好的基因定位结果，且能揭示差异个体的基因调控网络差异，但成本较高。为节约成本，本研究开发了一种利用转录组数据来实现混合分组分析的方法，该方法可结合转录组数据的差异表达基因分析，以及植物一年多熟的快繁技术，快速找出主效基因位点的候选基因。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基于转录组测序的基因定位的方法。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种基于转录组测序的基因定位的方法，包括以下步骤：

4、s1：确定目标性状，将目标性状差异大的植物材料a和植物材料b杂交创建近等基因系或残留异质系群体；

5、s2：将杂合单株进行株行种植，鉴定株行中每个单株的目标性状表型值，从每株行中分别取单株目标性状表达的器官作为后代材料待测样本，按照同样的方法同时取植物材料a和植物材料b的样本作为亲本待测样本；提取后代材料待测样本的rna，构建转录组测序文库；分别提取亲本待测样本的dna，构建基因组测序文库；

6、s3，对测序数据进行转录组和基因组数据处理与分析，得到后代和两个亲本的snp/indel注释信息详情表；去掉亲本和后代测序中测序质量差的位点，若任意一个位点出现质量差的情况，则把所有材料的该位点去掉；

7、s4，从转录组中选出带有snp位点的候选基因，以该植物材料的全基因组测序数据作为参考基因组，把候选基因比对到参考基因组上，即得到每个候选基因的snp位点在参考基因组中对应的位置；把候选基因按照其所属染色体进行归类排序，并根据基因在染色体上的起始位置信息按从小到大排序；

8、s5：在测序的后代材料中，把与植物材料a具有相同性状表型的作为a对应的后代ga，把与植物材料b具有相同性状表型的作为b对应的后代gb；分别计算每个snp/indel位点上ga中拥有a亲本基因型个体数占ga的比例p(a/a)，以及gb中拥有a亲本基因型个体数占gb的比例p(a/b)，通过滑窗法(slide window)处理背景噪音，选用1mb为窗口大小、1kb为步长，分别计算p(a/a)_index和p(a/b)_index，同时计算δindex，公式为：δindex＝p(a/a)_index-p(a/b)_index；以δindex＞0.8的区间作为候选基因区间。

9、其中，在步骤s1中创建近等基因系或残留异质系群体的方法为：确定目标性状，将目标性状差异大的植物材料a和植物材料b杂交得到f1代，f1代杂交得到f2代，再将f2代自交或回交5代以上得到杂合单株。

10、其中，在步骤s2中，从每株行中分别取5株以上单株目标性状表达的器官作为后代材料待测样本。

11、其中，在步骤s2中，分别提取亲本待测样本的dna，测序深度为10×，构建测序文库。

12、其中，在步骤s3中，测序质量差的位点为基因型显示./.的位点。

13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

14、本发明的方法不仅可以实现混合分组测序分析法(bulked segregate analysis-sequencing,bsa-seq)的目的基因初定位的结果，同时还能实现rna的混合分组测序法(bulked segregant rna-sequencing,bsr-seq)的表达量差异分析、功能富集分析等，实现bsa-seq和bsr-seq联合分析的目的，节约了试验成本。

技术特征：

1.一种基于转录组测序的基因定位的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s1中创建近等基因系或残留异质系群体的方法为：确定目标性状，将目标性状差异大的植物材料a和植物材料b杂交得到f1代，f1代杂交得到f2代，再将f2代自交或回交5代以上得到杂合单株。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s2中，从每株行中分别取5株以上单株目标性状表达的器官作为后代材料待测样本。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s2中，分别提取亲本待测样本的dna，测序深度为10×，构建测序文库。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤s3中，测序质量差的位点为基因型显示./.的位点。

技术总结
本发明公开了一种基于转录组测序的基因定位的方法，将目标性状差异大的植物材料A和植物材料B杂交创建近等基因系或残留异质系群体，利用基于重测序的转录组测序方法来实现正向遗传学定位的目的，同时还能利用其差异表达基因分析结果筛选候选基因，并分析差异目的性状个体的基因调控网络差异，大大节约了成本。

技术研发人员：陈文杰,覃夏燕,宁德娇,陈淑芳,郭小红,汤复跃,韦清源,韦荣昌,梁江,陈渊
受保护的技术使用者：广西壮族自治区农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29