用于培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基和方法与流程

本发明涉及微生物培养领域。具体地，本发明涉及一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌(a.muciniphila)的高密度培养基、获得培养基的方法及其相关应用。

背景技术：

1、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)是一种从人体肠道中分离的革兰氏染色阴性菌，其厌氧但是能耐受纳摩尔级别的氧，在肠道中含量丰富，约占肠道微生物总量的3-5％，分布于人肠道黏液层中，可以利用黏蛋白为唯一碳源、氮源。由于嗜黏蛋白阿克曼氏菌是哺乳动物肠道中唯一的疣微菌(门)成员，并且使用其16s rrna基因序列易于检测，因此大量报告表明肠道中阿克曼氏(akkermansia)属的丰度变化与宿主健康和疾病相关。

2、肠道菌群与宿主的各种生理过程例如能量摄入、免疫系统成熟和激素分泌密切相关。作为肠道菌群的重要成员，嗜黏蛋白阿克曼氏菌被认为是“下一代益生菌”之一，其丰度的变化与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等多种生理功能障碍显著相关。众多研究表明，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌活菌或经过巴氏杀菌后的死菌对小鼠给药后均导致小鼠体重和脂肪量增加减少，血清甘油三酯和空腹血糖水平下降，并提高了小鼠的胰岛素敏感性。嗜黏蛋白阿克曼氏菌调节糖脂代谢的机制可以通过其在屏障功能和免疫反应中的调节作用来解释，其代谢产物可以作为物质基础。此外，嗜黏蛋白阿克曼氏菌和产生丁酸盐的细菌之间潜在的交叉喂养和营养相互作用也可能促进丁酸盐的产生。这些短链脂肪酸可能会激活gpr43或gpr41，并进一步提供对脂质和葡萄糖代谢的调节。

3、许多研究表明，结肠炎和炎症性肠病(ibd)与嗜黏蛋白阿克曼氏菌丰度的改变有关。ibd患者中嗜黏蛋白阿克曼氏菌的丰度显著下降。与健康个体相比，已观察到便秘型肠易激综合征(c-ibs)患者肠道中的嗜黏蛋白阿克曼氏菌水平较高。携带c-ibs微生物群的动物表现出dss结肠炎的恢复，传统c57bl/6小鼠或人类微生物群相关大鼠与嗜黏蛋白阿克曼氏菌的预处理也减轻了结肠炎的严重程度。这些发现表明了c-ibs患者肠道菌群(尤其是嗜黏蛋白阿克曼氏菌)的抗炎作用。

4、同时，有研究表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌可能在自身免疫性疾病的发展和调节中发挥作用。喂养nod小鼠的无麸质饮食显示出自发性i型糖尿病的发生率较低，同时嗜黏蛋白阿克曼氏菌丰度增加。与对pd-1治疗无反应的癌症患者相比，有反应的癌症患者中嗜黏蛋白阿克曼氏菌尤其丰富。

5、尽管嗜黏蛋白阿克曼氏菌对健康有诸多益处，但是，目前为止，大规模培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌存在的瓶颈问题亟待解决。derrien等人公开了培养方法，另有中国专利号cn107849093b与中国专利号cn107384828b等基于derrien等公布的方法进行了相应的优化，但是这三种培养基均基于derrien等人提供的基础培养基。该基础培养基成分极其复杂，组成化合物约30种，发酵结束后下游加工过程中离心困难，离心得率极低，损失过大不利于工业生产。除此之外，该培养基中由于富含ca2+，高温高压灭菌后产生钙盐沉淀，对生产设备极为不利。此外，derrien等人与中国专利号cn107384828b公开的培养方法还涉及动物源成分，含有潜在过敏源等在食品药品生产中不被期望的成分。另外有发明人在利用其进行常规培养时，发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长受到培养基初始液面高低影响。中国专利号cn112342151b公开了一种培养方法，虽然不受液面高低限制，但是其改良基于bhi培养基，成分复杂，同样富含动物源成分且成本依旧高昂，且未对嗜黏蛋白阿克曼氏菌高密度发酵进行深入探究。另有中国专利号cn201910265701.0公开一种培养基，培养基成分虽然稍微简单一些，但是培养时间长达3天，且菌量较低，且未能探究高密度发酵。plovier h等人(apurified membrane protein from akkermansia muciniphila or the pasteurizedbacterium improves metabolismin obese and diabetic mice[j].nature medicine，2017，23(1)：107-113)公开了一种合成培养基，该培养基能够达到与黏蛋白相同的培养效率且不影响嗜黏蛋白阿克曼氏菌的生理效果，但是该培养基中化合物高达33种，仍旧未解决成分复杂、灭菌后产生大量沉淀、离心得率低、以及下游加工困难的问题。此外，该培养基中含有na2s·9h2o，该物质被严禁用于食品药品生产。

6、由于嗜黏蛋白阿克曼氏菌分离的特殊性(用含有黏蛋白的培养基分离得到)，导致研究者们对嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养基的探索陷入窠臼。迄今为止，公开的专利/专利申请中从未有研究者脱离黏蛋白的衍生物：葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、n-乙酰-d-葡萄糖胺、n-乙酰-d-半乳糖胺，其中尤其以葡萄糖与n-乙酰-d-葡萄糖胺最多。然而，这几种物质在培养基中高温高压灭菌过程中与氮源中的蛋白质及氨基酸发生剧烈美拉德反应，造成大量的营养物质的损耗，培养基褐化严重，并且美拉德反应产物还有一定的抑菌作用，可能对嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长造成不利影响。

7、传统的嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养基优化方法较为盲目，不能精准定位到嗜黏蛋白阿克曼氏菌生长所需的营养物质，对于研发人员时间精力所耗甚大。目前国内外培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌多采用黏蛋白培养基与改良bhi培养基，成本高昂，且培养多数在3-5天，严重阻碍了嗜黏蛋白阿克曼氏菌的大规模生产应用。另外，黏蛋白与bhi培养基主要成分(脑心浸出物)均为动物源产品，存在其他潜在风险，不适合用于人类食品或药品中应用。

8、因此，本领域需要一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的大规模、低成本、低损耗、高效的非动物源性培养基。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明的发明人首次将基因组规模代谢网络模型应用到嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)培养基的优化中，理论与实验相结合，最终获得成本低廉、成分简单、非动物源性的嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养基，可以实现对嗜黏蛋白阿克曼氏菌的高密度发酵生产。由此，完成了本发明。

2、因此，在本发明的第一方面，提供了一种用于培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)的培养基，其包括：

3、-2-200g/l的糖类，所述糖类选自二糖、低聚糖、多糖、及其任意组合；

4、-2-200g/l氨糖和/或氨糖聚合物，所述氨糖和/或氨糖聚合物选自d-氨基葡萄糖、d-氨基葡萄糖盐酸盐、n-乙酰-d-葡萄糖胺、n-乙酰-d-半乳糖胺、n-乙酰-d-甘露糖胺、壳寡糖、壳聚糖、甲壳素、及其任意组合；

5、-5-200g/l的非动物源性氮源，所述非动物源性氮源选自大豆蛋白胨、小麦蛋白胨、酵母浸粉、酵母蛋白胨、及其任意组合；

6、-0.1-20g/l的l-苏氨酸；

7、-0-50mm的还原剂，所述还原剂选自l-半胱氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸、谷胱甘肽、so32-、s2o32-、s2o42-、二氧化硫脲(ch4n2o2s)、及其任意组合；

8、-0-1g/l的钴胺素；

9、-0-10mm的mg2+；以及

10、-0-10g/l的缓冲盐，所述缓冲盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸钠、及其任意组合。

11、在第二方面，本发明提供了一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌(a.muciniphila)的方法，所述方法包括在第一方面所述的培养基中培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

12、综上，本发明基于基因组规模代谢网络模型，获得适于微生物如嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)生长的代谢摄入物质集，该集为优化培养基提供参考成分，然后基于实验获得代谢摄入物质集中促进微生物生长的成分，由此最终提供了用于嗜黏蛋白阿克曼氏菌的高密度培养基，该培养基减少了现有技术培养基中的冗余成分，不仅成分简单、成本低廉、不含动物源成分，而且能够将嗜黏蛋白阿克曼氏菌的活菌数提高至1010cfu/ml以上，为实现嗜黏蛋白阿克曼氏菌的工业化生产提供了可能。本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养基避免了包含多种无机盐，尤其是不包含ca2+，由此解决了现有技术的嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养基在高温高压灭菌产生沉淀的问题，避免了对发酵设备造成损害。并且该培养基不包含na2s·9h2o等严禁用于食品药品生产的成分，美拉德反应少，营养物质损耗少，由此得到细菌的生长状态好、增殖快、培养时长短、下游加工性能优越，离心得率更高，几乎没有加工损失。此外，本发明的非动物源性培养基避免了污染物或过敏原的存在，具有更高的安全性，能够满足食品工业和医药工业的生产要求。