本发明属于基因编辑领域,具体涉及胞嘧啶脱氨酶sfsdda、包含其的碱基编辑器及应用,可以有效实现真核细胞基因中c到t的转换。
背景技术:
1、crispr/cas系统以其方便、高效的优势成为近些年来应用最广的基因编辑工具。在sgrna的引导下,cas蛋白到达靶位点处切割产生双链断裂,联合后续的dna修复过程,借助于非同源末端连接实现基因敲除,或给予一段dna模板,借助于同源重组实现基因修复。然而同源重组介导的基因修复效率普遍不高,且会引入大量的插入与缺失。
2、更简便、高效且精准的单碱基编辑技术成为更有效地的纠正导致人类疾病点突变工具,也成为基因治疗研究的热门选择。目前开发的单碱基编辑系统主要包括胞嘧啶碱基编辑器(cbe)、腺嘌呤碱基编辑器(abe)、鸟嘌呤碱基编辑器(gbe)和先导编辑器(primeeditor)。
3、cbe的核心组成元件是ncas9或dcas9和胞嘧啶脱氨酶,cas9蛋白与胞嘧啶脱氨酶组成融合蛋白,还融合有尿嘧啶糖基化酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor,ugi)。具体工作原理:当融合蛋白在sgrna的引导下靶向基因组dna时,胞嘧啶脱氨酶可结合到由cas9蛋白、sgrna及基因组dna形成的r-loop区的ssdna处,将该ssdna上一定范围内的胞嘧啶(c)脱氨变成尿嘧啶(u),进而通过dna复制或修复将u转变为胸腺嘧啶(t),最终实现c/g碱基对至t/a碱基对的直接替换。由david liu实验室开发的cbe经历了四代升级,第四代胞嘧啶碱基编辑器:rapobec1-xten-ncas9-2ugi包含了大鼠的胞嘧啶脱氨酶(rapobec1),突变的cas9(d10a)-ncas9以及两个尿嘧啶糖基化酶抑制子,实现了编辑效率及精准度的不断提升。但作为cbe的核心部件,已有的胞嘧啶脱氨酶受到基因序列上下文限制、效率低而脱靶效应明显、由于尺寸过大而无法通过腺相关病毒(aav)病毒载体在体内运送等诸多限制。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种新型的胞嘧啶脱氨酶,用于优化cbe,上述新型的胞嘧啶脱氨酶为源自黄色糖多孢菌( saccharopolysporaflava)的单碱基dna脱氢酶(sdda),将其命名为sfsdda,是基于针对现有单碱基dna脱氢酶(sdda)数据的生物信息学分析发现的,sfsdda的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2、本发明还有一个目的是提供多核苷酸序列,表达如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶,其核苷酸序列如seq id no.2所示。
3、本发明还有一个目的是提供一种融合蛋白,氨基酸序列如seq id no.3所示,其包含cas酶域;胞嘧啶脱氨酶域以及ugi域;所述的胞嘧啶脱氨酶域为sfsdda。
4、本发明还有一个目的是提供一种表达上述融合蛋白的多核苷酸序列,其核苷酸序列如seq id no.4所示。
5、本发明还有一个目的是提供一种重组表达载体,其包含上述融合蛋白的多核苷酸序列。
6、本发明还有一个目的是提供一种遗传工程化的宿主细胞,包含上述的重组表达载体或基因组中整合有所述的融合蛋白的多核苷酸序列,以及sgrna,以及aav。
7、本发明还有一个目的是提供一种胞嘧啶单碱基编辑器,其特征在于,所述的胞嘧啶单碱基编辑器是将编码上述融合蛋白的多核苷酸序列整合到表达载体上得到。
8、本发明还有一个目的是提供上述胞嘧啶碱基编辑器在制备用于介导基因编辑的试剂中的用途,用于进行基因编辑,降低脱靶效应、提高靶向编辑效率或提高靶向编辑的保真度。
9、本发明还有一个目的是提供一种基因编辑方法,包括以所述的胞嘧啶碱基编辑器介导基因编辑,将编码所述的胞嘧啶碱基编辑器的多核酸序列以及sgrna共同注射受体,从而进行基因编辑,所述的受体包括:体细胞或生殖细胞,所述的生殖细胞包括胚胎细胞或受精卵。
10、本发明还有一个目的一种用于进行基因编辑的试剂或试剂盒,其包括上述sfsdda或上述胞嘧啶碱基编辑器。
11、本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
12、本发明通过研究报道的所有的ddda和sdda的数据,人为分类了其中数据集中的高活性蛋白,并进行了多序列比对生成种子数据集用于hmmer search,精简在生成数据库查询到的蛋白序列结果,然后与处理过的蛋白组进行多序列比对以构建进化树。由此在高活性蛋白的分支附近发现了尚未报道的sdda,将其作为候选蛋白来进一步进行结构比对,检查并且基于结构比对的结果选择了自于 saccharopolysporaflava的sdda作为最终候选胞嘧啶脱氨酶之一进行活性评估。
13、具体的本发明检测了sfsdda在hek293t细胞中4个核靶位点的编辑效率,在靶标的位置显示出高效的c到t的编辑效率。
14、由上述可知,本发明的包含sfsdda的cbe具有活性高、尺寸小等诸多优点,相比于现有其他cbe具有明显优势。
1.一种胞嘧啶脱氨酶,其特征在于:其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种多核苷酸序列,其特征在于,表达如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶,其核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种融合蛋白,其特征在于:其包含cas酶域;胞嘧啶脱氨酶域以及ugi域;所述的胞嘧啶脱氨酶域是如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶。
4.一种多核苷酸序列,其特征在于:表达如权利要求3所述的融合蛋白。
5.一种重组表达载体,其特征在于:其包含如权利要求4所述的多核苷酸序列。
6.一种宿主细胞,其特征在于:包含如权利要求5重组表达载体或基因组中整合有如权利要求4所述的多核苷酸序列,以及sgrna。
7.一种胞嘧啶单碱基编辑器,其特征在于,所述的胞嘧啶单碱基编辑器是将如权利要求4所述的多核苷酸序列整合到表达载体上得到。
8.如权利要求7所述的胞嘧啶碱基编辑器在制备用于介导基因编辑的试剂中的用途,包括用于基因编辑,降低脱靶效应、提高靶向编辑效率或提高靶向编辑的保真度。
9.一种基因编辑方法,其特征在于,包括以如权利要求7所述的胞嘧啶碱基编辑器介导基因编辑,将编码所述的如权利要求4所述的多核苷酸序列以及sgrna共同注射宿主细胞。
10.一种用于进行基因编辑的试剂或试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶或如权利要求7所述的胞嘧啶碱基编辑器。